전통적인 Restriction enzyme을 활용한 Cloning의 경우, overhang되는 nucleotide가 많아야 4~6개 정도 밖에 안되기 때문에 특이도도 떨어지고, 효율성의 측면에서 안타까운 점이 많다. Gibson assembly는 Restriction enzyme site에 구애받지 않으며, T5 exonuclease의 특성을 활용하여 더 특이적이고 효율적으로 Cloning을 수행할 수 있다. 마지막으로 동시에 여러개의 assembly를 동시에 한번에 반응시킬 수 있어 시간이 엄청나게 단축되며 편리하다.
Primer design
Gibson assembly는 서로 fusion 하고자 하는 fragment 부위에 15~20 bp 정도의 homology 서열이 중복되도록 디자인한다. 2개 이상의 fragment를 fusion하고자 하는 경우, 겹치는 부분이 20bp 이상이 되도록 한다. Primer의 3′ portion의 5bp는 2개 이상의 G or C가 포함되지 않도록 한다. Primer의 전체 Tm 값이 50도 보다 높아야한다. 50도보다 높지 않을 경우, homology sequence의 길이를 더 늘려서 50도를 넘기도록 한다.
T5 exonuclease
Gibson assembly는 T5 exonuclease의 특성을 활용한 기법이다. 해당 효소는 5′ 방향부터 차례로 nucleotide를 떨어뜨려주는 특성을 가지고 있다.
Gibson Assembly 활용
Gibson assembly는 여러 개의 fragment를 동시에 그것도 restriction enzyme site에 구애받지 않고 반응 시킬 수 있어 유용한 분자생물학적 tool이다. 특히 Cloning 과정 중에 Insert와 Backbone 등을 restriction enzyme으로 digestion하고 gel-purification 해야했던 귀찮은 과정 없이, 모든 product를 High-fidelity PCR Rxn을 이용하여 준비하여 바로 반응시키면 된다. 여러 fragment를 assembly로 준비하여 socket 처럼 서로를 결합시킬 수 있다.
Gibson assembly 방법을 소개한 NEB site 동영상
[참고문헌]
Gibson, Daniel G., et al. “Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.” Nature methods 6.5 (2009): 343.
두마디 정밀의료 