최근에 관심이 있는 유전자를 Knock-out 시킨 세포주를 이용하여 실험을 하려고, CRISPR-Cas9 system을 이용한 Knock-out stable cell line을 제작하고 있습니다. 이전에 포스팅한대로, sgRNA를 디자인하고 제작한 벡터를 만들면 다음 단계로는 해당 유전자를 세포주의 유전체에 끼워 넣어야 하는데, 이때 Lentivirus를 이용하게 됩니다. 그래서 이번 포스팅에서는 Lentivirus를 이용하여 유전체를 전달하는 과정과 관련된 배경 지식들을 정리해보고자 합니다.
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I. Lentivirus의 특성과 이용
Lentivirus는 Retroviridae 에 속하는 RNA 바이러스로 숙주에 본인의 genome을 끼워넣는 것이 특징입니다. Lenti-는 “slow”를 뜻하며, 따라서 증식 속도가 상대적으로 느린 것이 특징입니다. 대표적으로 AIDS를 일으키는 것으로 잘 알려진 HIV도 lentivirus의 일종으로 알려져 있습니다. 이러한 바이러스의 특징을 바탕으로, Lentivirus는 특정 세포주에 관심있는 유전체를 전달하는 연구용 도구로 많이 사용하고 있습니다. 실험자가 바이러스에 감염되지 않도록 생물학적 안정성 (Biosafety)은 높히고, 다양한 세포주에 유전체를 잘 전달 (Transduction)하는 연구용 Lentivirus가 많이 개발 및 개량되어 사용되고 있고, 현재는 2세대 또는 3세대 Lentivirus를 많이 사용하고 있다고 합니다. 따라서, 연구용으로는 아래와 같은 3가지 Component로 구성된 벡터를 이용하여 Lentivirus particle을 생산합니다.
- Transfer vector: 전달하고자 하는 관심있는 유전자를 포함하는 벡터
- Packaging vector: Gag, Pol, Rev, Tat 등 바이러스 packaging 연관 유전자를 포함하는 벡터로 2세대의 경우는 1개, 3세대의 경우는 2개의 벡터로 이루어진다.
- Envelope vector: 바이러스의 가장 바깥 envelope 관련 유전자를 포함하는 벡터
II. Lentivirus 세대별 특성 및 바이러스 입자 생성
위의 그림은 Addgene에서 정리된 표를 가져왔습니다. 2세대의 경우 Packaging plasmid가 1개이고, 3세대의 경우는 2개입니다. 2세대의 경우는 Packaging plasmid와 Envelope plasmid를 모두 2세대로 사용해야 하지만, 3세대의 경우는 2세대와 함께 사용하는 것이 가능하다고 합니다.
Lentivirus는 일반적으로 HEK293T 세포에 3개의 plasmid를 co-transfection 시켜서, 바이러스 입자를 생성시키고, 정량 및 정제 후에 원하는 세포주에 처리해서 유전체가 잘 전달된 세포를 선별적으로 구분(Selection)하여 Stable cell line을 제작합니다. 마지막으로 개념 이해를 위해 잘 정리된 유튜브 영상을 첨부하고 포스팅을 마칩니다.
[Reference]
두마디 정밀의료 
지훈아, 잘 지내지? 나 찬식이야.
정말 본받을 점이 많은 지훈이 모습에 내 자신이 많이 부끄럽구나.
내가 학위때 crispr-cas9 시스템으로 lenti viral vector 제작하고 knock-out cell line 만든 경험이 있어서.
혹시 cell line 만드는 과정에서 어려운 부분이 있다면 내가 조금이라도 도와주어 시간을 지훈이 아낄 수 있을까 싶어서 이렇게 오랜만에 글 남겨 ㅎㅎ
나보다 더 많이 잘 알겠지만 혹시 관련해서 도움 필요하면 얘기하길!
훌륭하다!
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찬식아 오랜만이다. 잘지내고 있니?
정말 고맙구나. 다행히 주위에 도움을 받을 수 있는 분들이 많아서 큰 고생없이 진행하고 있어.
혹시라도 도움이 필요하면 연락할게. 정말 든든하다 고마워!
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안녕하세요! 이번에 lentiviral vector를 공부하고 있는대요!! 영상을 보고나니 궁금한게 여러개 생겨서 여쭤봐요ㅜ
1. 2세대나 3세대 LTR을 보면 그 옆에 promoter가 또 존재하는데 LTR의U3에는 enhancer와 promoter가 있는데 왜 promoter가 2개씩이나 필요하나요??
2. 3세대 보면 LTR의 U3부분을 대신해 CMV를 장착했는데 얘도 좀 좀더 강한 그냥 promoter일뿐인데 TAT가 왜 필요없나요!
3. 3세대에서 LTR이 다른 세포에 인전해 proto-oncogen 세포를 유전자 발현할까봐 U3를 삭제하는데 TAT도 그런 역할을 할 수 있어서 삭제하나요?
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저도 해당 내용은 전문이 아니라서 잘 모르겠네요.
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답변 감사합니다 ^_________^
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