[실험실 노트] CRISPR-Cas9 절단 효율 검출

앞선 포스팅에서 CRISPR-Cas9의 개념과 실험 디자인에 대해서 소개하였는데, 실제 디자인한 guideRNA의 절단 효율을 확인하는 방법에 대해서 정리해 보고자 합니다.

관련포스팅 보기>

[실험실 노트] 유전자 가위 CRISPR/Cas9을 이용한 Gene Editing

일반적으로 sgRNA의 target site 절단 효율은 mismatch cleavage enzyme을 이용하여, indel이 발생한 위치를 찾아 자르고 gel loading을 해서 band를 통해 확인하는 방법을 이용합니다. 아래 그림과 같이 Cas9 단백이 작동해서, indel을 발생시켰다면 원래 DNA와 re-anneal을 시켰을때, mismatch가 발생하게 되고, 이러한 mismatch를 인식해서 절단하는 효소로 처리하게 되면, indel이 유도된 DNA는 절단되어 2개의 band로 보이고, 유도되지 않은 DNA는 절단되지 않게 되어 1개의 band로 보이게 됩니다. 이 비율을 확인함으로써, 얼마나 indel이 효율적으로 발생하였는지를 확인하는 것인 Genomic Cleavage Detection Kit의 원리가 됩니다.

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그러나 이러한 키트는  따로 구매해야하고 보통 가격이 비쌉니다. 가장 좋은 방법은 NGS를 해서 생산된 Read의 indel을 분석하는 것인데, 이것은 더 비쌉니다. 따라서 좀 더 간편하고 저렴한 방법을 찾게 되는데, 옆 연구실에 여쭤보니 타겟 영역을 생거 시퀀싱한 후에 아래의 사이트 (TIDE) 에 분석을 하면 대략적인 indel의 percentage을 구할 수 있다고 합니다. 이때, 생거 시퀀싱을 위한 amplicon과 primer는 아래와 같이 디자인합니다. Indel이 없는 정상 Amplicon이 필요하고, 대략적인 indel 비율을 생거 시퀀싱 데이터의 높이를 통해서 구해주는 것이기 때문에 다소 부정확할 수 있다는 점은 염두해야겠습니다.

TIDE: Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition

 

[Reference]

Brinkman, Eva K., et al. “Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.” Nucleic acids research 42.22 (2014): e168-e168.

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