플라스미드를 이용하여, 원하는 유전자를 세포에서 단백질로 발현시키려고 하다보면 종종 동시에 다양한 마커가 필요하게 됩니다. 원하는 세포만 Selection 하기 위한 항생제 내성 유전자를 도입한다던지, 형광 현미경에서 유전자가 들어간 세포만 골라보기 위해서 형광 단백질을 동시에 발현시킨다던지 하는 경우가 말이죠. 저도 최근에 이러한 목적으로 실험 디자인과 문헌을 찾다보니, 어렴풋이 알고 있던 IRES와 2A sequence에 대해서 공부하게 되어서, 관련 내용을 정리해보려고 합니다.
Cistron은 Gene (유전자)와 동의어입니다. 따라서, Multi-cistronic vector는 동시에 여러 개의 유전자를 발현하는 벡터를 말합니다. 하나의 Promotor를 이용하여, 동시에 여러 개의 유전자를 발현시키는 방법은 크게 아래와 같은 2가지가 사용됩니다.
IRES (Internal Ribosome Entry Site)
IRES라고 하는 5~600bp의 sequence를 추가해주면, 단백 합성을 하는 ribosome이 중간에 와서 해당 부위부터 단백 합성을 시작하게 됩니다. 이 방법의 단점은 IRES sequnce의 크기가 상대적으로 커서, 발현하고자 하는 유전자의 크기가 상대적으로 큰 경우에는 벡터 내에 넣기에 부담스러울 수 있다는 점과 뒤 쪽의 두번째 유전자는 상대적으로 발현량이 떨어질 수 있다는 점에 있습니다.
2A peptide
IRES의 단점을 극복하기 위한 방법으로 2A peptide 방법이 고안되었습니다. 2A peptide는 20개 내외의 아미노산 서열로 DNA 수준으로는 60bp 정도로 훨씬 크기가 작습니다. 더불어 동시에 전사가 시작되어, 해당 부위의 Gly과 Pro 서열에서 Ribosome skipping이 일어나면서, 아미노산 서열이 절단 (Self-cleavage)되는 것을 이용하는 것이기 때문에 2가지 유전자의 단백이 거의 동등하게 발현되는 장점이 있습니다. 2A peptide는 비슷한 종류가 여러가지 존재하는데, 세포의 종류나 유전자에 따라서 절단 효율이 모두 다르기 때문에 어떤 하나가 더 좋다고는 하기 어렵습니다. 그러나 대부분 절단이 잘 되기 때문에 어떠한 시퀀스를 이용해도 좋다고 합니다.
위의 내용은 아래 링크의 Addgene 블로그에 잘 설명되어 있습니다. 더불어, 마지막의 첨부 논문은 유전자의 개수와 2A 펩타이드의 종류에 따른 절단 효율을 비교한 논문인데, 해당 논문의 결과를 참고하여 가장 절단 효율이 좋은 2A 펩타이드를 결정하는 것도 좋을 것으로 생각됩니다.
[References]
두마디 정밀의료 
2A peptide 또한 뒤에 들어간 유전자의 발현양이 낮다는 단점이 있습니다. 뿐만 아니라 직접 테스트해보니 2A peptide는 잘 작동하는데 삽입한 유전자의 C-term쪽에 일부 추가된 서열에 대한 검증이 필요하다는 것이 어렵습니다. 차라리 IRES을 합성해서 넣거나 Origin이 다른 vector 두개를 사용하는 편이 좋을 것 같습니다.
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좋은 코멘트 감사합니다. 사실 뭐든 직접해보지 않으면 잘 모르는법이죠. 저는 최근에 T2A로 벡터를 만들어서 확인해보니 잘 작동하더군요. 2A peptide의 장점은 크기가 작다는 점일거 같고 역시 어떤 유전자냐에 따라서 말씀하신대로 차이가 있을것 같네요.
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