[실험실 노트] Organoid의 기본 개념과 활용

최근에 진행 중인 연구 중에 Organoid modeling을 하면 좋을 것 같은 결과를 얻어서, Organoid에 대해서 공부한 내용들을 간단하게 정리할까 합니다. 3D culture 또는 Organoid에 대해서는 이쪽 분야만 전문적으로 연구하시는 분들도 많지만, 이제는 저 같은 일반 연구자들도 Cell culture와 같이 하나의 연구 방법론으로 많이 사용하는 시대가 온 것 같습니다. 그만큼 일반적인 Cell culture로는 한계가 있던 것을, Organoid를 이용하면 좀 더 인체와 가깝게 모델화할 수 있는 장점 때문에 앞으로는 Organoid를 이용한 실험이 더 보편화 되지 않을까 합니다. 본 포스팅에서는 Organoid 제작을 위한 주요 개념들을 정리해 보고자 합니다.

 

I. Organoid의 장점과 한계

Organoid는 기존의 2D culture (평면으로 cell을 깔아서 키우던 시절)에서 3D culture (3차원적인 형태로 세포들이 뭉쳐서 크는 시절)의 과도기에서 벗어나 실제 Organ과 같은 형태로 세포를 키워서 조금 더 실제 기능을 모방한다는 장점이 있습니다. 따라서 대부분의 장점은 질병의 모델화가 용이하고, 실제 생리적 기능을 더 가깝게 확인할 수 있는 도구라는 점입니다. 그러나 실제 기관 (Organ)은 한 종류의 세포로 이루어져 있는 것이 아니며, 훨씬 복잡한 세포들이 다양한 형태를 이루고 있기 때문에, Organoid의 한계점은 이러한 점을 모두 모방하기 어려운데서 기인합니다. 아래는 아래 Review 논문에서 언급하고 있는 Organoid의 장점과 단점입니다.

 

  • Near-physiological model system for studying adult stem cells and tissues in a variety of contexts
  • Adult stem cells can be propagated in organoids, and specific tissue lineages can be cultured in high purity with minimal contributions from other cell types
    (for example, fibroblasts and endothelial cells)
  • Can be propagated for a long time (years) without genomic alterations
    Amenable to a wide variety of established experimental techniques
  • Can be derived from multiple sources: adult and foetal tissues, ESCs and iPSCs
  • Can generate organoids encompassing a broad range of tissues
  • Limited amounts of starting material can be expanded for numerous applications
  • Human diseases that are difficult to model in animals can be studied with patient-derived organoids
  • Possibility of generating isogenic adult tissue for transplantation in regenerative procedures

 

  • Lack of native microenvironment precludes studies about interaction of stem cells with their niches, immune cells, etc.
  • Limited use in modelling inflammatory responses to infection or drugs due to absence of immune cells in culture system
  • Unable to mimic in vivo growth factor/signalling gradients in Matrigel matrix
  • Unable to mimic biomechanical forces that stem cells encounter in vivo
  • Relatively rigid ECM could limit drug penetration, hence hampering the use of organoids in drug screens
  • Challenging to culture organoids from tissues whose niche factors are not well understood (for example, the ovary)
  • Organoids in the same culture are heterogeneous in terms of viability, size and shape, impeding phenotype screens
  • Organoid cultures depend on mouse-sarcoma-derived Matrigel, which precludes transplantation of organoids into humans

 

II. Organoid 제작 source: primary tissue, ESC, and iPSC

실제 organoid modelling을 계획할 때, 제작 방법을 고민하게 되는데 크게 위의 3가지 source로 부터 제작이 가능하게 됩니다. 환자로 부터의 sampling 가능 여부와 실험 가능 여부 등을 고민하면서, 동시에 각 방법의 장, 단점을 함께 이해하는 것이 중요합니다.

아래 그림은 primary tissue, embryonic stem cell (ESC), induced pluripotent stem cell (iPSC)를 통해서 oragnoid를 제작하는 과정을 보여주고 있습니다. Primary tissue의 경우에는 조직에서 부터 줄기세포만을 추출하는 과정이 필요하고, ESC의 경우는 얻기가 어려우며 윤리적인 문제가 걸려있고, iPSC의 경우는 가장 얻기 쉬우며 용이한 반면, 제작에 시간이 많이 소모된다는 단점이 있습니다. iPSC는 유도 만능 줄기 세포 또는 역분화 줄기 세포로 불리는데, 두번째 그림과 같이 대표적인 4개의 인자들을 이용하여 이미 분화된 세포를 역으로 거슬러 오르게해서 다시 분화능을 갖는 세포를 만든 것으로 2012 년 노벨 생리의학상을 받은 야마나카 신야에 의해서 개발된 방법입니다.

  1. Primary Tissue: 환자 유래의 실제 조직으로 부터 organoid를 제작하는 방법. 조직에 포함된 소량의 줄기 세포를 분리하고, 줄기 세포를 확장 시켜서 oragnoid로 제작
  2. Embryonic Stem Cell (ESC): 배아 줄기 세포를 직접 이용하는 방법, 얻기가 쉽지 않고 윤리적 문제가 걸려 있어 최근에는 잘 이용되지 않고 있다.
  3. induced Pluripotent Stem Cell (iPSC): 환자의 피부 조직과 같이 얻기 쉬운 세포를 이용하여 역분화 과정을 거친 유도 만능 줄기 세포를 제작한 후, 이를 통해서 다시 Organoid를 제작하는 방법. 활용이 다양하고 윤리적인 문제도 적지만, 역분화 과정에 추가로 시간이 걸리는게 단점.

Figure1

16385

[Liver Organoid 제작 과정]

Figure3

 

III. Organoid 활용

아직까지 대부분의 Organoid는 연구용으로 질병 모델화에 활용되고 있습니다. 그러나 아래 그림과 같이 환자 유래의 세포로 Organoid를 제작하여 약물 Screening을 시행하여 환자에게 맞춤 치료를 제공한다거나,  재생 의학적 측면에서 세포 이식 치료에 활용하는 방법들도 시도되고 있습니다.

Figure2

Figure4_00001

 

[References]

Fatehullah, Aliya, Si Hui Tan, and Nick Barker. “Organoids as an in vitro model of human development and disease.” Nature cell biology 18.3 (2016): 246.

Prior, Nicole, Patricia Inacio, and Meritxell Huch. “Liver organoids: from basic research to therapeutic applications.” Gut 68.12 (2019): 2228-2237.

광고

[실험실 노트] Multi-cistronic vector design: IRES와 2A peptide

플라스미드를 이용하여, 원하는 유전자를 세포에서 단백질로 발현시키려고 하다보면 종종 동시에 다양한 마커가 필요하게 됩니다. 원하는 세포만 Selection 하기 위한 항생제 내성 유전자를 도입한다던지, 형광 현미경에서 유전자가 들어간 세포만 골라보기 위해서 형광 단백질을 동시에 발현시킨다던지 하는 경우가 말이죠. 저도 최근에 이러한 목적으로 실험 디자인과 문헌을 찾다보니, 어렴풋이 알고 있던 IRES2A sequence에 대해서 공부하게 되어서, 관련 내용을 정리해보려고 합니다.

multi.jpg

CistronGene (유전자)와 동의어입니다. 따라서, Multi-cistronic vector는 동시에 여러 개의 유전자를 발현하는 벡터를 말합니다. 하나의 Promotor를 이용하여, 동시에 여러 개의 유전자를 발현시키는 방법은 크게 아래와 같은 2가지가 사용됩니다.

 

IRES (Internal Ribosome Entry Site)

IRES

IRES라고 하는 5~600bp의 sequence를 추가해주면, 단백 합성을 하는 ribosome이 중간에 와서 해당 부위부터 단백 합성을 시작하게 됩니다. 이 방법의 단점은 IRES sequnce의 크기가 상대적으로 커서, 발현하고자 하는 유전자의 크기가 상대적으로 큰 경우에는 벡터 내에 넣기에 부담스러울 수 있다는 점과 뒤 쪽의 두번째 유전자는 상대적으로 발현량이 떨어질 수 있다는 점에 있습니다.

 

2A peptide

2A

IRES의 단점을 극복하기 위한 방법으로 2A peptide 방법이 고안되었습니다. 2A peptide는 20개 내외의 아미노산 서열로 DNA 수준으로는 60bp 정도로 훨씬 크기가 작습니다. 더불어 동시에 전사가 시작되어, 해당 부위의 Gly과 Pro 서열에서 Ribosome skipping이 일어나면서, 아미노산 서열이 절단 (Self-cleavage)되는 것을 이용하는 것이기 때문에 2가지 유전자의 단백이 거의 동등하게 발현되는 장점이 있습니다. 2A peptide는 비슷한 종류가 여러가지 존재하는데, 세포의 종류나 유전자에 따라서 절단 효율이 모두 다르기 때문에 어떤 하나가 더 좋다고는 하기 어렵습니다. 그러나 대부분 절단이 잘 되기 때문에 어떠한 시퀀스를 이용해도 좋다고 합니다.

위의 내용은 아래 링크의 Addgene 블로그에 잘 설명되어 있습니다. 더불어, 마지막의 첨부 논문은 유전자의 개수와 2A 펩타이드의 종류에 따른 절단 효율을 비교한 논문인데, 해당 논문의 결과를 참고하여 가장 절단 효율이 좋은 2A 펩타이드를 결정하는 것도 좋을 것으로 생각됩니다.

 


[References]

Addgene: Plasmids 101: Multicistronic Vectors

Szymczak-Workman, Andrea L., Kate M. Vignali, and Dario AA Vignali. “Design and construction of 2A peptide-linked multicistronic vectors.” Cold Spring Harbor Protocols 2012.2 (2012): pdb-ip067876.

Liu, Ziqing, et al. “Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector.” Scientific reports7.1 (2017): 2193.

[실험실 노트] CRISPR-Cas9 절단 효율 검출

앞선 포스팅에서 CRISPR-Cas9의 개념과 실험 디자인에 대해서 소개하였는데, 실제 디자인한 guideRNA의 절단 효율을 확인하는 방법에 대해서 정리해 보고자 합니다.

관련포스팅 보기>

[실험실 노트] 유전자 가위 CRISPR/Cas9을 이용한 Gene Editing

일반적으로 sgRNA의 target site 절단 효율은 mismatch cleavage enzyme을 이용하여, indel이 발생한 위치를 찾아 자르고 gel loading을 해서 band를 통해 확인하는 방법을 이용합니다. 아래 그림과 같이 Cas9 단백이 작동해서, indel을 발생시켰다면 원래 DNA와 re-anneal을 시켰을때, mismatch가 발생하게 되고, 이러한 mismatch를 인식해서 절단하는 효소로 처리하게 되면, indel이 유도된 DNA는 절단되어 2개의 band로 보이고, 유도되지 않은 DNA는 절단되지 않게 되어 1개의 band로 보이게 됩니다. 이 비율을 확인함으로써, 얼마나 indel이 효율적으로 발생하였는지를 확인하는 것인 Genomic Cleavage Detection Kit의 원리가 됩니다.

이 슬라이드 쇼에는 JavaScript가 필요합니다.

그러나 이러한 키트는  따로 구매해야하고 보통 가격이 비쌉니다. 가장 좋은 방법은 NGS를 해서 생산된 Read의 indel을 분석하는 것인데, 이것은 더 비쌉니다. 따라서 좀 더 간편하고 저렴한 방법을 찾게 되는데, 옆 연구실에 여쭤보니 타겟 영역을 생거 시퀀싱한 후에 아래의 사이트 (TIDE) 에 분석을 하면 대략적인 indel의 percentage을 구할 수 있다고 합니다. 이때, 생거 시퀀싱을 위한 amplicon과 primer는 아래와 같이 디자인합니다. Indel이 없는 정상 Amplicon이 필요하고, 대략적인 indel 비율을 생거 시퀀싱 데이터의 높이를 통해서 구해주는 것이기 때문에 다소 부정확할 수 있다는 점은 염두해야겠습니다.

tide-protocol-1

TIDE: Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition

 

[Reference]

Brinkman, Eva K., et al. “Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.” Nucleic acids research 42.22 (2014): e168-e168.

[실험실 노트] Real Time-PCR의 원리와 qPCR primer를 이용한 CNV 확인

오늘은 RT-PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction)의 기본적인 원리와 실험적으로 이용하기 위한 resource들을 정리하는 포스팅을 남기고자 합니다.

 

I. Realtime-PCR과 PCR의 차이

Realtime PCR (RT-PCR)은 그 이름에서 알 수 있듯이, 실시간 (Real-Time)으로 증폭 산물 (PCR product)을 Monitoring 한다는 것이 PCR과 가장 큰 차이입니다. 일반적으로 RT-PCR은 정량 (Quantitation)이 가능하기 때문에 qPCR이라고도 합니다.

  • RT-PCR은 일반적으로 RNA에서 cDNA를 만든 후에 PCR을 진행하는 Reverse-Transcription PCR을 지칭합니다. 그러나, 경우에 따라 Realtime PCR도 약자로 줄여서 RT-PCR이라고 부르기도 하기 때문에, Reverse-transcription과 Real-time을 구분하여 혼동하시지 말기를 바랍니다. 이 글에서의 RT-PCR은 Real-time PCR을 지칭하는 것으로 하도록 하겠습니다.

이 때 일반적으로 Monitoring을 형광을 이용하게 되는데, DNA에 비특이적으로 끼어들어가 형광을 나타내는 SYBRQuencher를 이용하여, PCR 합성이 진행되면 형광을 나타내도록 하는 Taqman probe 등이 많이 사용됩니다.

TaqMan-Gene-Expression-Assay-720
[Taqman probe의 작동 원리]
최종 산물을 이용하는 PCR과 다르게 RT-PCR은 최초의 DNA 량을 역으로 정량 (또는 반정량)할 수 있다는 장점이 있습니다. 이를 위해서는 아래의 RT-PCR amplification curve를 잘 이해하는 것이 중요합니다. 일반적으로 PCR은 1 cycle이 돌 때마다 효율이 100% 라고 가정하면, 2배씩 증폭됩니다. 그러나, 실제로는 PCR에 dNTP들이 점점 소모되기 때문에 반응이 진행되면서 효율은 점점 떨어지게 되고, 아래와 같은 형태의 curve를 이루게 됩니다. 이때, 처음 증폭 산물을 검출할 수 있는 Threshold를 넘는 지점의 Cycle 수를 Ct 값이라고 이야기하고, Ct 값은 처음 DNA양과 역비례하게 됩니다. (즉, 처음 DNA 양이 많으면 증폭을 적게 시켜도 검출이 되고, 처음 DNA 양이 적으면 많이 증폭 시켜야 검출 한계를 넘게됩니다.)

PCR

II. qPCR primer design 및 활용 (Delta-delta Ct method)

qPCR은 PCR을 해서 증폭 산물을 얻는 것이 아니라, 해당 위치만 효율적으로 증폭시켜 추적하는 것이 목적이기 때문에 길이는 너무 길지 않는 것이 좋습니다. 따라서 target의 위치는 80~150 bp 정도로 되도록 하고, Melting curve analysis를 통해서 하나의 산물만 증폭되는 것을 확인합니다. 타겟 산물의 Tm은 65~95도 정도 되도록, GC나 AT rich region을 피합니다. 아래 2개의 사이트에서는 해당 유전자의 시퀀스를 넣으면 자동으로 primer를 디자인하여 주기 때문에 유용하게 사용 가능합니다. 더불어 하나의 미세한 팁은, Origene에서는 유전자별로 미리 디자인된 qPCR용 primer를 판매하면서 해당 시퀀스를 공개하고 있습니다. 따라서, 해당 시퀀스를 따와서 합성 주문하는 것도 한가지 팁이 됩니다. (다만, 가끔 잘못 올라온 경우도 있어서 합성 주문 전에 미리 잘 확인해볼 필요가 있습니다.) 최종 주문 전에 이전에 소개했던 툴 등을 이용하여, Hairpin structure, in-silico PCR 등을 돌려보는 것이 도움이 됩니다. 사실 이런 모든 과정이 귀찮다면, 마지막의 PrimerBank에서 검색해서 제시된 primer를 이용하면 됩니다.

관련 포스팅 보기>

[실험실 노트] Sanger sequencing Primer design

[qPCR primer design을 위한 툴]

GenScript RT PCR primer design tool

Eurofin qPCR primer design tool

OriGene pre-designed primer 정보 얻기

PrimerBank Database 활용 – **

일반적으로 RT-PCR은 정량 (Quantitation)이 가능하기 때문에 qPCR이라고도 하며, 일반적으로는 유전자 발현 상대량 (mRNA expression)을 구하거나, Copy-Number Variation을 확인하는 데 사용 가능합니다. 이 때, 중요한 개념은 ∆Ct method 인데, 서로 다른 2개의 target이라 하더라도 증폭되는 비율의 차이는 서로 다른 샘플 간에도 일정하다는 원리를 이용하는 것입니다. 이를 수식으로 나타내면 아래와 같습니다.

∆Ct = Ct (Gene of interest) – Ct (Reference gene)

즉, 하나의 샘플 안에서 서로 다른 2개의 타겟을 디자인해서 증폭하면, 위치 간에 증폭 효율이 있기 때문에 Ct 값에 차이가 필연적으로 존재합니다. 그러나 이 차이는 Gene of interest와 Reference gene간의 상대량에 변화가 없다면, 서로 다른 샘플 간이라 하더라도 일정해야 합니다. 그러나, 둘 간의 상대량에 변화가 발생하면 ∆Ct 값도 변화하게 되고, 따라서 ∆Ct의 차이 (∆∆Ct)를 계산하면, 원하는 타겟 (Gene of interest)의 상대량을 구할 수 있게 됩니다.

마지막으로 이러한 원리 (Delta-delta Ct method)를 이용하여, Copy-Number Variation을 구할 수 있는 실험에 대해서 잘 설명하고 있는 유튜브 영상을 남깁니다.

 

[References]

Ma, Lijiang, and Wendy K. Chung. “Quantitative analysis of copy number variants based on real‐time LightCycler PCR.” Current protocols in human genetics 80.1 (2014): 7-21.

How To Perform The Delta-Delta Ct Method

 

[실험실 노트] Lentivirus의 특성 및 연구 활용

최근에 관심이 있는 유전자를 Knock-out 시킨 세포주를 이용하여 실험을 하려고, CRISPR-Cas9 system을 이용한 Knock-out stable cell line을 제작하고 있습니다. 이전에 포스팅한대로, sgRNA를 디자인하고 제작한 벡터를 만들면 다음 단계로는 해당 유전자를 세포주의 유전체에 끼워 넣어야 하는데, 이때 Lentivirus를 이용하게 됩니다. 그래서 이번 포스팅에서는 Lentivirus를 이용하여 유전체를 전달하는 과정과 관련된 배경 지식들을 정리해보고자 합니다.

관련 포스팅 보기>

[실험실 노트] 유전자 가위 CRISPR/Cas9을 이용한 Gene Editing

 

I. Lentivirus의 특성과 이용

lentivirus-production-mirus-bio-recombinant

LentivirusRetroviridae 에 속하는 RNA 바이러스숙주에 본인의 genome을 끼워넣는 것이 특징입니다. Lenti-는 “slow”를 뜻하며, 따라서 증식 속도가 상대적으로 느린 것이 특징입니다. 대표적으로 AIDS를 일으키는 것으로 잘 알려진 HIV도 lentivirus의 일종으로 알려져 있습니다. 이러한 바이러스의 특징을 바탕으로, Lentivirus는 특정 세포주에 관심있는 유전체를 전달하는 연구용 도구로 많이 사용하고 있습니다. 실험자가 바이러스에 감염되지 않도록 생물학적 안정성 (Biosafety)은 높히고, 다양한 세포주에 유전체를 잘 전달 (Transduction)하는 연구용 Lentivirus가 많이 개발 및 개량되어 사용되고 있고, 현재는 2세대 또는 3세대 Lentivirus를 많이 사용하고 있다고 합니다. 따라서, 연구용으로는 아래와 같은 3가지 Component로 구성된 벡터를 이용하여 Lentivirus particle을 생산합니다.

  1. Transfer vector: 전달하고자 하는 관심있는 유전자를 포함하는 벡터
  2. Packaging vector: Gag, Pol, Rev, Tat 등 바이러스 packaging 연관 유전자를 포함하는 벡터로 2세대의 경우는 1개, 3세대의 경우는 2개의 벡터로 이루어진다.
  3. Envelope vector: 바이러스의 가장 바깥 envelope 관련 유전자를 포함하는 벡터

 

II. Lentivirus 세대별 특성 및 바이러스 입자 생성

lenti generation

위의 그림은 Addgene에서 정리된 표를 가져왔습니다. 2세대의 경우 Packaging plasmid가 1개이고, 3세대의 경우는 2개입니다. 2세대의 경우는 Packaging plasmid와 Envelope plasmid를 모두 2세대로 사용해야 하지만, 3세대의 경우는 2세대와 함께 사용하는 것이 가능하다고 합니다.

lentiviral-packaging

Lentivirus는 일반적으로 HEK293T 세포에 3개의 plasmid를 co-transfection 시켜서, 바이러스 입자를 생성시키고, 정량 및 정제 후에 원하는 세포주에 처리해서 유전체가 잘 전달된 세포를 선별적으로 구분(Selection)하여 Stable cell line을 제작합니다. 마지막으로 개념 이해를 위해 잘 정리된 유튜브 영상을 첨부하고 포스팅을 마칩니다.

 

 

[Reference]

Addgene: Lentiviral Guide

[실험실 노트] 유전자 가위 CRISPR/Cas9을 이용한 Gene Editing

최근에는 유전자 가위 기술이 워낙 보편화되어서, 일반 연구자들도 실험을 할 때 특정 유전자를 Knock-Out 시키기위해서 CRISPR/Cas9을 많이 이용하는 것 같습니다. 저도 최근에 특정 유전자의 기능을 연구하면서, 해당 유전자를 Knock-Out 시키기 위해서CRISPR/Cas9을 이용하려고 하다보니, 해당 메커니즘이나 원리를 제대로 한번 정리해볼 필요가 있다는 생각이 들었습니다. 그래서 이번 포스팅은 흔히 유전자 가위라고 불리는 CRISPR/Cas9 의 작동 원리와 해당 원리를 이용한 타겟 유전자 편집에 대해서 정리해 보고자 합니다.

CRISPR/Cas9의 발견 및 기본 원리

FA_Cas9_Fig1_Cas9InVivo

CRISPR : Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

Cas: CRISPR-Associated protein

gRNA: guide RNA, crRNA: CRISPR RNA

PAM sequence: Protospacer-Adjacent Motif

CRISPR/Cas9는 원래 처음 대장균 (E.coli)에서 발견되었는데, 세균이 외부의 바이러스의 침투로 부터 스스로를 지키기 위한 면역 체계의 일종입니다. 세균이 스스로 CRISPR 단백을 만들어서, 외부의 바이러스의 유전체는 잘라버리는 특성을 우연히 발견한 후에 해당 원리를 이용한 것이 최근의 유전자 가위 기술의 토대입니다. CRISPR의 가장 큰 장점은 guideRNA가 CRISPR 단백을 자를 위치로 이동 시켜주기 때문에, 자르고 싶은 곳의 서열에 맞춰서 gRNA를 잘 디자인하면 원하는 부위에 타겟팅이 용이하다는 점입니다. CRISPR의 특징이자 제한점은 흔히 PAM sequence (일반적으로 -NGG-)라고 부르는 특이 서열을 인식하여 유전자 가위가 작동하기 때문에, 타겟 영역에 PAM sequence가 존재해야한다는 점입니다.

CRISPR/Cas9을 이용한 유전자 편집

1

위의 그림은 CRISPR/Cas9을 이용한 유전자 편집 과정에 대해서 잘 설명해주고 있습니다. 실험 설계를 위해서는 크게 1) guide RNA 디자인, 2) Vector 등을 이용하여 디자인한 gRNA와 Cas9 단백을 발현하는 형질을 세포 등의 시스템에 도입, 3) 정상적으로 발현이 될 경우, 타겟 DNA 절단 의 과정을 거칩니다. 마지막으로, 타겟 세포에서는 정상적인 수리 과정인 NHEJ 또는 HDR 과정을 거치는데, 이 과정을 이용하여 Knock-Out 또는 Knock-In 이 가능합니다.

CRISPR/Cas9 guide RNA 디자인 방법 Resource

아래 자료는 타겟 영역을 자르는 guide RNA를 디자인하는 방법을 잘 설명해주고 있습니다.

How to design sgRNA sequences by TAKARA

manual-sgRNA-design-6951-T

디자인된 sgRNA가 실제로 잘 작동할지를 컴퓨터로 예측해주는 많은 툴들이 개발되었는데, 아래는 그러한 툴들이 잘 정리되어 있습니다. 일반적으로 가장 절단 효율이 좋고, 특이적으로 작동할 것으로 예측되는 2~3개의 sgRNA를 만들어서 실제 실험을 하고, 가장 좋은 것을 이용한다고 합니다.

Choosing the right tool for designing guide RNAs

Broad Institute: GPP Webportal

마지막으로 Addgene에 CRISPR 기술에 대해서 잘 정리된 글이 있어, 함께 첨부합니다.

CRISPR Guide by Addgene

유전자 변형 마우스 제작과 기본 개념

유전체 연구를 하다보면, 많은 후보 유전자들의 이상을 발견하게 되고 실제 질병 발생 메커니즘을 재현하기 위해서 mouse를 모델로 선택하게 됩니다. 사람과 mouse는 99%의 유전체가 동일하고, 다양한 장점 (다루기 쉽고, 세대가 짧고, 저렴하여 실험이 용이) 때문에 유전체 이상에 의한 질병 발생의 동물로 많이 이용하게 됩니다. 이번 포스팅에서는 mouse를 이용한 유전자 이상 동물 모델을 재현하기 위해 필요한 유전자 변형 마우스 (Genetically-Engineered mouse; GEM)와 관련된 내용들을 정리해 보고자 합니다.

Cloning_update_20150417_1042

 

I. Transgenic vs. Knock Out: 넣을 것인가 vs 뺄 것인가?

Transgenic mouse는 추가적으로 관심있는 유전자를 삽입하는 경우이므로 유전자의 duplication 등으로 질병으로 발생하는 경우 (Gain-of-Function) 에 적합한 모델이고, Knock-Out (KO) mouse는 관심있는 유전자의 기능을 망가뜨리는 경우로 해당 유전자의 기능을 확인하거나 Loss-of-Function의 메커니즘을 확인하는 경우에 적합한 모델입니다. Knock-in mouse는 타겟 유전자를 제거함과 동시에 다른 유전형으로 삽입시켜서 치환하는 경우를 말합니다.

 

II. Conditional Knock-out: Tissue-specific vs Time-dependent

발생 과정에 매우 중요한 유전자의 경우에는 KO 시킬 경우, mouse 자체가 발생 단계에서 죽어버려서 (embryonic lethal) 어떠한 기능을 하는지 보기가 어렵습니다. 따라서 특정 유전자의 경우에는, 관심있는 질병이 발생하는 조직에서만 KO 시키거나 (Tissue-specific) 또는 발생 단계가 정상적으로 일어나게 한 이후에 특정 시기(Time dependent)에서만 Gene KO을 유도시키는 물질을 투여함으로써, KO 시키는 전략을 씁니다.

tissue-specific-knockout-mouse

inducible-knockout-mouse-b

 

III. 마우스 제작의 전반적인 단계

566px-Knockout_mouse_production_2.svg

  1. 타겟 유전자 Vector 제작: 관심있는 유전자를 타겟으로 하는 벡터를 제작한다
  2. 쥐의 Embryonic stem cell (ES cell)에 해당 벡터를 넣어, Homologous recombination 과정을 통해 관심 유전자를 KO 시킨 cell을 selection marker를 통해 선택해낸다.
  3. Recombination이 일어난 ES cell을 정상 착상 시켜서 KO gene이 hetero zygote로 존재하는 새끼를 탄생시킨다.
  4. heterozygote KO된 새끼 쥐끼리 교배 시켜서, homozygote를 갖는 쥐를 탄생시키고, 해당 쥐의 형질을 관찰한다.

위의 과정에 대한 전반적인 과정은 아래 Youtube 영상에 잘 정리되어 있다.

 

 

https://www.youtube.com/watch?v=ht8c2elD2OA

 

IV. 유전자 변형 마우스 관련 Resource 및 Database

 

다음 링크에 대표적인 마우스 관련 Database가 정리되어 있습니다.

https://www.mmrrc.org/about/resources.php

 

위 페이지에 소개된 곳 중에서 주로 많이 참고하는 사이트와 자료는 아래와 같습니다.

Mouse Genome Informatics (MGI): Jackson Laboratory에서 제공하는 Mouse genome portal, mouse genome에 대한 전반적인 정보를 얻을 수 있는 곳

International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC): 쥐의 유전형과 관련 형질에 대한 연구를 하기 위한 국제 컨소시엄

Mutant Mouse Resource & Research Centers (MMRRC): NIH에 의해 지원되고 있는 MMRRC Repository database

European Mutant Mouse Archive (EMMA): 유럽 지역의 연구 중심 마우스 포털 사이트

KMPC에서 제공하는 국내 마우스 포털 Mouse One Portal: http://mouseinfo.kr/

마우스 변형 유전자 마우스에 관한 내용을 잘 정리한 페이지: http://www.cellmigration.org/resource/komouse/komouse_approaches.shtml

 

Cre loxp system, CRISPR/Cas9을 이용한 KO 등 추가로 알아야할 내용들은 나중에 정리하도록 하고, 이번 포스팅은 여기에서 마무리하도록 하겠습니다.

[실험실 노트] Problems amplifying GC-rich regions? Problem Solved!

PCR 실험 도중 유용한 글이 있어 스크랩한다.


Problems amplifying GC-rich regions? Problem Solved!

No, it isn’t you that’s the problem, and you’re certainly not alone if you’re having trouble amplifying GC-rich sequence and/or understanding why GC-rich sequences are causing such problems in the first place! Amplification of GC-rich sequences by PCR has been an irritant for scientists for decades! When we say “GC-rich” we mean ?60% of the bases are either cytosine (C) or guanine (G.) There are several options available, which alone or in combination may help you to deal with this problem, but first let’s look at why GC-rich sequences are more difficult to amplify.

 

The Cause of Your Problems

 

Problem 1. Stability: Thermal and Structural

GC-rich DNA sequences are more stable than sequences with low GC-content. For PCR, this means that the higher the GC content, the higher the melting point of the DNA. Under pressure, such as when exposed to heat, the GC-rich sequences can take far more abuse than GC-low sequences. While the possible role of meditation and yoga having a calming effects on these bases allowing them to take more abuse and still stick together has not yet been investigated, the impact of their structure has been. GC-rich DNA sequences are more stable than sequences with low GC-content, but, contrary to popular belief, the hydrogen bonds are not the primary reason for this stability. Stabilization is mainly due to stacking interactions called base stacking. There is some beautiful biochemistry and biophysics behind this and if you’re interested  is a fantastic explanation as to why this stacking occurs.

Fun fact! This is why Thermus thermophilus, an extremophile, has a GC-rich genome, also regions of our genome (assuming of course that you are human) that need to been transcribed very often such as promoter regions of popularly transcribed gene, are AT-rich, like the TATA box- neat huh?!

 

Problem 2. Formation of Secondary Structures

This point is very much tied to the first point. When GC-rich regions form secondary structures, particularly hairpin loops, they’re very stable and so they stick around and accumulate. These don’t melt well at usual PCR denaturation temperatures. Additionally, primers used to amplify GC-rich regions have a tendency to form self- and cross-dimers as well as stemloop structures that can impede the progress of the DNA polymerase along the template molecule leading to truncated PCR products. GC-rich sequences at the 3’ end of primers can also lead to mispriming.

What a disaster!

Poof! *the sounds of your confidence in your ability to do PCR deflating*

But wait! We have some solutions for you!

 

Solution 1. Increasing Your Melting Temperature

This is a very sensible solution (in theory.) The higher the temperature, the more likely those troublesome secondary structures formed by GC-rich regions are to separate. However this results in lower product yields as your taq begins to denature more quickly at temperatures in excess of 92.5°C, so it is advisable to only use higher melting temperatures for the first few cycles and to avoid going over 95°C. It might take some playing around but this is solution is a good starting point.

 

Solution 2. Adjusting Your Magnesium Concentration

Non-specific amplification in general can be exacerbated and even caused by using excessive concentrations of magnesium (Mg) so test the optimum concentration using gradient or titration PCR. In a nutshell, your well on the absolute left contain a less than what you think will work and your well on the absolute right contain an excessive amount of magnesium with a gradient in the middle so you can determine the lowest possible amount you can use to achieve your product.

 

Solution 3. Calling upon a friend:

I found a few recipes online that various labs have found worked well for them:

  1. Addition of 3-10% dimethyl sulfoxide (DMSO), most often 5%
  2. Addition of 1M betaine and 5% DMSO – these may reduce your enzyme activity so add extra enzyme
  3. Addition of betaine (Sigma), DMSO, DTT and BSA
  4. Addition of ethylene glycol with 1,2-propanediol
  5. Addition of 5 % DMSO and 1.25% formamide or just formamide
  6. Addition of 5 – 10% absolute glycerol and higher temperature of annealing
  7. Use regular HotStart and add 2M betaine
  8. Use Kapa’s HiFi Hot Start enzyme
  9. Use KAPA3G GC rich Kit with 5% DMSO
  10. GC enhancers available in various kits like this Clontech, Epicentre and Qiagen also both offer kits for this problem if you’ve some money to spare.

Some of these options are beautifully summarized with links to references here. We also have a post detailing different PCR additives and how they can help you.

 

Solution 4. Other types of PCR

  1. Nested-PCR: I’ve written entirely on this technique so stay tuned for that!
  2. Slowdown-PCR: explored here.
  3. Hot-Start PCR.
  4. Long range PCR: clontech and qiagen both offer kits for this problem if you’ve some money to spare.

These forms of PCR and more are described simply and briefly here.

So you’ve looooads of options! Let us know what has worked for you in the comments below.

 

[References]

https://bitesizebio.com/24002/problems-amplifying-gc-rich-regions-problem-solved/

 

Base stacking: Kool ET. (2001)  Hydrogen bonding, base stacking, and steric effects in DNA replicationAnnu Rev Biophys Biomol Struct.  30:1–22.

Betaine and DMSO: Bhagya CH, et al. (2013) Polymerase Chain Reaction Optimization for Amplification of Guanine-Cytosine Rich Templates Using Buccal Cell DNA. Indian Journal of Human Genetics 19.1:78.

Ethylene glycol with 1,2-propanediol: Zhizhou, Z. et al. (2009)Enhanced Amplification of GC-rich DNA with Two Organic ReagentsBioTechniques 47.3 : 775-79. Web

Using formamide in PCR: Sarkar, G., et al. (1990). Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucleic Acids Research, 7465-7465.

 

[실험실 노트] Sanger sequencing Primer design

최근 시퀀싱 검사의 대세는 NGS 이지만, 여전히 논문을 위한 논문에서는 Gold standard인 Sanger 시퀀싱 결과를 Supple data로 요구하고 있다. 이번에 유전자 30개 정도되는 NGS 패널을 디자인하고, 검출된 변이로 Sanger 시퀀싱 확인 및 가족 검사 까지 진행하고 있는데, M모 업체를 통해 견적을 받아보니 타겟 위치 셋업 비용 10만원 + 검체 추가당 3만원 + Blood에서 DNA 추출 검체당 3만원을 달란다. 의뢰할 검체가 50여개는 되어서 정말 정말 귀찮지만, 연구비는 소중하니까.. 에라잇.. 주말을 전부 바쳐 직접 노가다로 진행하고 5백만원을 아끼자 마음 먹었다ㅠㅠ 그래서 오늘의 실험실 노트는 생어 시퀀싱을 위한 Primer 디자인 과정을 남겨 본다.

Figure_14_02_04ab

 

I. 검체 Blood에서 DNA 추출하기

남들이 많이 사용하는 Q사의 Blood DNA Extraction Kit를 사용한다. Manual에서 하라는 대로 따라하니까, 크게 무리 없이 DNA가 잘 뽑혀져 나온다. 다만, 검체가 오래되었거나 WBC count가 적은 경우, 또는 Blood volume이 procedure에서 요구하는 200uL보다 적은 경우에는 마지막에 elution volume을 좀 작게 해야될 것 같다. (방법은 정말 쉽지만, 검체가 50개의 스케일로 넘어가는 순간 정말 노가다.. 파이펫 팁만 몇개를 쓴 건지… 대부분의 과정이 기계에 의해 자동화되어 있던 진단검사의학과 검사실의 풍경이 눈 앞을 아른거린다ㅠㅠ)

 

II. 타겟 영역 선정 및 Primer 디자인하기

0. 논문들의 supplement data를 잘 살펴보자. 다른 논문에서 이미 디자인된 primer 정보가 있다면 적극 활용하자. (재현만 잘 되면 새로 짤 필요 없다.)

a. NGS 검사에서 나온 변이들의 exon을 골라, 유전자와 exon number, 그리고 올바른 transcription mode에 해당하는 NM number를 정리한다.

b. Ensemble Genome Browser를 이용해, NM number를 통해 해당 위치에 접근하여, exon 영역과 앞 뒤 200bp 정도를 포함하는 시퀀스를 display한다. (GRCh37, hg19 등 Genome Version이 맞는 사이트로 접근)

c. Sanger 시퀀싱을 할 경우, 읽는 primer 뒤로 50~100 bp는 퀄리티가 나빠 제대로 안읽히기 때문에 primer는 최소한 타겟 영역의 100bp 이상 앞쪽에서 잡는다. Forward와 Reverse간의 간격은 500bp 전후로 적당히 잡는다. 어차피 8~900 bp 넘어가면 그 뒤는 퀄리티가 나빠져서 못 읽는다.

d. GC contents 40~60%이고, primer 길이 20~25bp 정도 되는 시퀀스를 골라서 Forward와 Reverse 서열을 선택한다. 이때 선택한 서열을 primer 평가 프로그램을 통해, dimer 또는 hairpin 이 형성되지는 않는지 살피고, 서로의 Tm 값이 5도 이상 차이나지 않도록 한다. Reverse primer의 경우, pick-up한 시퀀스의 Reverse Complement 서열로 주문해야한다.

Primer 평가: http://www.premierbiosoft.com/NetPrimer/AnalyzePrimer.jsp

Tm 값 계산: https://tmcalculator.neb.com/

시퀀스 뒤집기: http://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html

e. UCSC Genome Browser에서 제공하는 In-silico PCR을 통해, pick-up한 primer가 원하는 영역에 잘 PCR 되는지 시뮬레이션 해본다. (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr)

f. 디자인한 primer를 업체에 주문한다.

g. I에서 뽑은 DNA와 주문한 primer로 PCR 반응 시킨다. 이때, Ta 값은 Tm 값보다 2~3도 낮은 온도에서 시작해서, 잡밴드가 많이 뜨면 온도를 더 높혀본다. 최적의 PCR 조건을 찾아서 원하는 타겟 영역을 증폭시킨다. (Gradient PCR를 해서 최적 온도를 찾는 것도 좋은 방법)

h. 원하는 크기의 타겟 영역의 밴드가 뜨면, product를 purification 해서 업체에 생어 시퀀싱을 의뢰한다.

 

타겟 영역별 프라이머 주문비용: 만원 / 시퀀싱 비용 검체당 대략 5천원 내외 / 전체 예상 소요 비용 50만원도 안됨.

1/10 도 안되는 가격으로 원하는 결과를 얻었다. (뿌듯..)

 

단점: 엄청난 노가다 및 손이 많이 감. Primer design 및 최적 PCR 조건을 찾는데 어려움이 있을 수 있다. 안되면 Primer를 다시 짜서 재주문해야됨. 되도록 Primer는 22~25bp 정도로 길게 잡자.(그래야 잡밴드가 적게 뜬다.)

 

[스크랩] PCR에서 GC enhancer의 역할

PCR 관련 제품 제조회사에서 GC enhancer, band helper 등등으로 판매하는 제품이 어떠한 원리로 작동하는지 검색하다가 유용한 답변이 있어, 스크랩한다.

해당 solution에는 betaine과 비슷한 물질이 포함되어 있는데, 이 물질은 AT의 이중 수소 결합과 GC의 삼중 수소 결합에 영향을 미치고, 결론적으로 GC 결합의 안정도를 AT 결합보다 더 떨어뜨려 AT와 GC의 안정도의 차이를 줄여주는 효과를 일으킴으로써 GC content의 차이에 의해서 PCR이 영향을 받는 걸 줄여준다.

main-qimg-ad7fb3afac4660909d81a470b96afee0

  • Betaine has a sequence independent destabilizing effect on all DNA base pairing interactions due to its charged nature. This reduces the stability of hydrogen bonds and lowers the Tm of AT and GC rich regions by roughly the same amount. With this effect alone, GC rich regions would still have higher Tm’s relative to AT rich regions.
  • Betaine also binds preferentially to the major groove of AT sites due to a slight hydrophobic effect between betaine and thymine’s major groove methyl group. This has a sequence dependent stabilizing effect that increases the stability of the double strand DNA in AT regions relative to GC regions.

 

[Reference]

Why do some PCR kits include GC Enhancer solution? What does this chemical do?