오늘 포스팅은 유전체 검사 후 발견되는 변이 해석에 대해 얘기해 보고자 합니다. 사실 최근에 제가 공부한 내용이라, 조금 어려운 내용이지만 해당 내용을 정리할 겸 포스팅을 남겨봅니다.
NGS 기술이 널리 사용되면서, 검사를 통한 변이 검출에 대한 문제는 이제 어느 정도 정상 궤도에 올랐다고 볼 수 있습니다. 사실 더 중요한 문제는 검출된 변이를 해석하고, 이를 실제 의료 현장에서 적용하는데 있습니다. 이제서야 이러한 문제가 이슈가 되고 있는 것은 시간의 흐름대로 과거 생거 시퀀싱을 통한 유전자 검사와 NGS 기술의 등장을 생각하면, 이해하기가 쉽습니다.
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과거 10년 정도 임상 현장 (병원)에서는 계속 유전자 검사를 해왔고, 실제 진료 (유전병 진단 등)에도 사용을 해왔습니다. 그러나 이때는 주로 생거 시퀀싱에 기반한 유전자 검사 였기 때문에, 매우 한정된 지역 (흔히 mutation hot spot이라고 불리는 부분)을 검사하거나 단일 유전자 1~2개의 엑손 부위 등을 검사하였죠. 이러한 유전자 검사를 시행하더라도, 검출되는 변이는 그리 많지 않았습니다. 그리고 질병과 알려진 변이 외의 변이는 검출된다 하더라도 크게 관심이 없었습니다. 사실 그러한 변이는 딱히 해석할 방법이 없었다는게 더 정확할지도 모르겠습니다. 따라서 그 동안 주요 변이 해석은 다음과 같이 이루어졌습니다.
- Family segregation: 가계도 분석을 통해, 대부분의 유전병 원인 유전자 및 변이를 추정하는 방식.
- Computational prediction algorithms: Polyphen-2, SIFT 등과 같은 단백질의 아미노산 서열 및 기능적 중요도 (conservation)에 기반한 컴퓨터 예측 알고리즘.
- Data sharing: 연구자 또는 임상 의사들 간의 진료 경험 및 축적된 데이터를 커뮤니티 또는 학회에서 공유해오던 방식.
- Traditional functional assays: 주로 in vitro assay를 통해 개별적인 논문에서 실험하고 변이의 효과를 입증해오던 방식.
하지만 NGS 기술이 등장하면서, 더이상 위의 접근 방식들로는 변이들을 해석하는데 한계에 다다르게 됩니다. 가장 널리 사용되는 컴퓨터 알고리즘 방식의 경우는 위양성률이 높고, 제한적인 데이터에 기반하기 때문에 정확한 정보를 주지 못하는 경우가 많습니다. 그리고 전통적인 변이의 functional assay의 경우는 가장 정확한 방법이기는 하지만, 매우 제한적인 몇몇 변이에 대해서만 실험 및 논문 보고가 이루어졌기 때문에 모든 검출 변이에 대해 정보를 제공하는데 한계가 있었습니다 (low through-put).
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NGS의 다른 이름인 Massively parallel sequencing 처럼, 엄청나게 방대한 시퀀싱 데이터를 통해 생산된 변이 데이터는 더이상 한 두개의 유전자 수준이 아닌 거의 질병과 관련된 모든 유전자의, 모든 변이들을 검출 가능하게 하였습니다. 상황이 이렇다 보니, 검출된 대부분의 변이들은 VUS (Variant of Unknown Significane)로 분류되는 상황이 잦아지게 되었죠. 쉽게 말해 ‘어떤 의미를 가지는 변이인지 모르겠다.’ 입니다.
따라서 뒤따라오는 문제는 Massive하게 검출되는 변이들 처럼, 변이들의 기능적 특성에 대해서도 Massive하게 검사해서 확인할 필요가 있게 되었습니다 (High through-put Functional assay). 그래서, 하나의 대안으로 최근 주목 받는 검사 방법이 오늘 소개하고자 하는 Multiplexed assays for variant effect (MAVE)입니다.
- Construction of a variant library: 검사하고자 하는 기능 유전자에 해당하는 가능한 모든 위치의 변이를 포함하는 library를 구축합니다.
- Delivery of this variant library to a model system: E.coli, Yeast, 또는 mammalian cell과 같이 유전자를 발현시켜 검사하고자하는 model system에 library를 집어 넣습니다.
- A functional assay: 발현된 단백질의 기능을 기능 검사를 통해 평가합니다. 보통은 selection 방법을 이용하여, selection 전 후의 어떤 기능을 가진 변이가 더 많이 또는 더 적게 존재하는지를 정량합니다.
- Sequencing to quantify each variant’s representation: 위의 기능 검사 전 후의 발현의 상대적인 비율을 sequencing을 통해 비교하게 됩니다.
- Calculation and calibration of functional scores: 위에서 얻은 비율을 일종의 기능적 점수로 환산하여 평가합니다.
- The genotype–phenotype relationship at every position: 모든 위치의 변이에 대한 기능적 지도가 완성됩니다.
위의 MAVE의 방법은 변이 해석에 대한 새로운 high throughput method로 앞으로 정밀 의료를 실현하는데 있어, 유용한 genotype–phenotype relationship 정보를 제공해줄 것으로 기대가 됩니다. 그러나 다음과 같은 제한점 및 후속 연구가 필요합니다.
- Model system의 한계: E.coli, Yeast, Mammalian cell과 같이 변이 라이브러리를 발현 시킬 적당한 모델이 있어야 하지만, 어떤 유전자에 대해서는 이것이 불가능할 수도 있습니다.
- Functional assay를 통한 selection: 사실 유전자가 발현되어 생긴 단백의 기능은 한 가지만 정해져 있는 것이 아닙니다. 하나의 단백이 여러가지 일을 동시에 수행하기 때문이죠. 따라서 검사해야할 functional assay가 무궁무진하게 많을 수도 있고, 그 각각을 표준화하기가 매우 어렵습니다. 또한 발현 전후의 상대적인 양으로 그 기능을 평가한다는 것이 과연 단백질의 정확한 기능을 반영하는 것인가에 대해서도 생각해볼 문제입니다.
- 컴퓨터 알고리즘 개선: 기능적 점수를 포함하는 새로운 컴퓨터 알고리즘을 개발하여, 좀 더 정확하게 변이의 효과를 예측하는데에 위의 데이터가 사용될 수 있습니다.
최근에 위의 MAVE 방법론을 이용하여 PPARG 유전자의 기능적 지도가 완성되어, Nature genetics에 소개된 바가 있습니다. 논문에서 저자들은 컴퓨터 알고리즘에 기반한 예측보다 MAVE 방법이 더 변이의 기능을 설명하는데 더 유용하다는 것을 보이기도 했습니다. 앞으로는 이처럼 아마 NGS 기술의 발전되고 많은 변이가 보고됨에 따라서, 그 기능적 해석과 관련된 부분에 대해서도 많은 관심과 연구가 진행될 것으로 생각이 됩니다. 그에 따라 하나의 방법론으로써 MAVE는 아직 몇가지 한계점이 있지만 좋은 대안이 될 것으로 생각됩니다. 그리고 궁극적으로는 모든 주요 유전자에 대한 변이의 기능적 예측을 높은 정확도로 얻을 수 있는 기능 지도가 완성되어, 데이터 베이스의 형태로 제공되기를 연구자들은 희망하고 있습니다.
사실 오늘 포스팅은 MAVE에 대해 매우 간략하게 정리한 것이라, 이해하기 어려울 수도 있을 것 같습니다. 관심이 있으신 분들을 아래 논문들을 더 살펴보시면 좋을 것 같습니다.
[참고 문헌]
Starita, Lea M., et al. “Variant Interpretation: Functional Assays to the Rescue.” The American Journal of Human Genetics 101.3 (2017): 315-325.
Gasperini, Molly, Lea Starita, and Jay Shendure. “The power of multiplexed functional analysis of genetic variants.” Nature protocols 11.10 (2016): 1782-1787.
Majithia AR, Tsuda B., et al. “Prospective functional classification of all possible missense variants in PPARG.” Nature Genetics 2016 Dec;48(12):1570-1575.
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