이전에 언급했던 면역항암제 (Immunotherapy) 의 성공과 더불어, 최근에는 어떠한 암 환자에서 면역 항암제가 효과적으로 쓰일 수 있을지를 예측하는 동반 진단 (Companion Diagnostics) 마커 발굴에 많은 관심이 쏠리고 있습니다. 지금까지 알려진 바로는 다양한 요인들이 면역항암제의 반응성에 영향을 미친다고 보고되고 있는데, 대표적인 인자로 알려진 것들에는 현미부수체 불안정성 종양 (MSI-H; Micro-satellite instability high tumor), PD-L1 발현 종양, 종양 돌연변이 부하 (Tumor Mutation Burden; TMB)가 높은 종양, 환자의 면역 인자 (특정 HLA-allele 등)이 반응성과 잘 연관되어 있다고 알려져 있습니다.
특히, Tumor Mutation Burden의 경우, TMB이 높을수록, 단백질의 변이에 의한 신항원(Neo-antigen)의 발현 확률도 높아지고, 이질적인 항원 발현에 의한 면역 반응으로 종양 세포가 제거될 확률도 높아지게 될 것이기 때문에, 이미 이전부터 당연하게 예측되는 결과 이기도 했습니다. 이러한 면역 항암제의 반응성과의 연관성 때문에, 최근에는 많은 연구에서 계산된 TMB을 함께 요구하고, 임상적으로도 환자 치료시 활용하려고 시도하고 있습니다. 이에 Tumor Mutation Burden의 의미와 영향을 미치는 인자들, 그리고 계산 방법에 대해서 정리해보겠습니다.
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TMB은 종양 내에 얼마나 많은 돌연변이가 발생했는가?를 수치화한 것으로 얼핏 생각하면 매우 단순한 개념처럼 보이기도 합니다. 그러나 매우 이질적이도 다양한 종양처럼, TMB을 정의하는 것도 그렇게 단순하지가 않습니다.
I. Tumor Mutation Burden의 정의
TMB은 원래 처음 전장 엑솜 시퀀싱 (Exome sequencing)에 의해서, 1Mb당 검출된 모든 종양 돌연변이의 개수를 수치화한 값으로 정의하였습니다. 즉, (분자 = 돌연변이의 총 갯수)/(분모 = 엑손 영역의 총 길이)가 됩니다. 여기서 문제가 발생하는데, 아직까지 표준화된 정의가 없습니다.
- 분자항의 변이의 영역을 어디까지 포함할 것인가? : 논문에 따라서 변이를 counting할 때, Non-synonymous variant만 포함하는 논문도 있고, Non-sense, frame-shift를 전부 포함하는 논문도 존재합니다.
(그렇다면 small insertion과 deletion은요??) - 분모항의 엑손 영역은 어떻게 정의할 것인가? : 엑솜 영역은 전체 유전체의 약 2% 정도로 단백질을 코딩하는 부위로 정의를 하는데, 이전에 언급한대로 엑솜 시퀀싱은 타겟시퀀싱과 동일하게 enrichment kit를 사용하여, 해당 엑손 부위만 증폭 시킵니다. 그러나 문제는 시중에 나와있는 다양한 회사의 키트들에서 엑손 영역이라고 말하는 부위가 서로 100% 일치하지 않습니다. 즉, 어떤 회사의 엑손 키트를 사용하였는가에 따라서도, 분모의 값이 달라지게 됩니다. (사실 아직까지도 100% 유전자라고 하는 부위의 정의도 확립되어 있지 않습니다.) 일반적으로 엑솜 영역의 크기는 5~60 Mb 정도 됩니다.
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II. Tumor Mutation Burden에 영향을 미치는 인자들
다음으로, TMB의 개념은 시퀀싱에 기반한 방법이기 때문에, 검사의 민감도가 결과에 절대적으로 영향을 미칩니다. 종양은 종양 이질성 (Tumor heterogeneity)으로 인해, 다양한 변이를 가진 미세 군집이 존재하게 됩니다. 따라서, 검체의 어떤 부분을 시퀀싱하는가?, 얼마나 더 민감하게 검사를 하는가?에 따라서, 해당 변이가 검출될수도, 되지 않을수도 있습니다. 따라서 종양 세포의 비율과 순도 (purity), DNA 추출 과정, 그리고 시퀀싱의 측면에서 Coverage 또는 Depth가 매우 중요하게 작용합니다. 즉, 일반적으로 Depth가 높아지면, 더 민감하게 검출이 되므로 TMB 값은 커지기 마련입니다. 다음으로, 검사 자체의 측면 이외에도 시퀀싱 데이터를 처리하면서 Bioinformatics pipeline에서 분석을 할 때, VAF (Variant allele frequency) cut-off를 얼마로 설정할 것인가에 따라서도 값이 매우 달라지게 됩니다. 즉, 시퀀싱 에러와 미세 군집 사이를 적절하게 구분짓는 최적의 cut-off 설정 또한 검사자에게 요구 됩니다. 더불어, matched normal sample의 유무에 따라, 적절하게 Germline variant를 filtering 하는 것도 매우 중요하다고 할 수 있겠습니다.
III. Target panel을 이용한 Tumor Mutation Burden 계산
최근에는 엑솜 시퀀싱이 아닌, 일부 유전자를 타겟으로 하는 타겟 패널에서 TMB을 계산하기도 합니다. 전체 유전자는 대략 2만여개 정도로 알려져 있는데, 수백개의 유전자로 이루어진 패널에서 이를 같은 방식으로 계산하는 것이기 때문에, 일부가 전체를 대표하게 됩니다. 따라서, 패널의 크기가 크면 클수록 엑솜 시퀀싱과 비슷한 결과를 보이게 됩니다. 여기서 최소 몇개의 유전자로 이루어진 얼마나 큰 패널로 검사를 시행해야 거의 동일하고 비슷한 값을 얻을 수 있는가?에 대한 문제가 발생하게 됩니다. 아래는 다양한 타겟 패널과 분석 플랫폼을 비교한 표입니다. 여기서 가장 중요한 것은 어떤 플랫폼으로 검사하는가에 따라서 검사 결과가 매우 다르다는 점입니다. 아래 그림은 서로 다른 영역을 타겟으로 하는 다양한 패널에서 계산되는 TMB의 차이를 나타내주고 있습니다.
따라서, 마지막으로 임상의사 선생님들께 남기고 싶은 얘기는 TMB의 절대값은 의미가 없다 라는 점입니다. 즉, 어떠한 플랫폼에서 어떠한 검사 기준을 적용하여, 어떻게 검체를 처리했는가에 따라서 TMB의 값은 매우 크게 달라질 수 있기 때문에, 같은 플랫폼 내에서 서로를 비교하는 상대값으로써 더 의미가 크다고 할 수 있겠습니다. 또한, TMB을 임상적으로 활용하기 위해서는 검사실에서 SOP를 수립하고, 표준화된 정의와 기준을 수립하는 것도 앞으로 매우 중요하겠습니다.
두마디 정밀의료 