NGS 타깃 시퀀싱 패널 검사의 분석 및 해석시 고려할 사항

지난 포스팅에서는 임상의의 입장에서 NGS 검사를 통한 변이의 해석을 이해하기 위한 기초적인 내용들을 언급했습니다.

<관련 포스팅 보기>

임상의를 위한 NGS 레포트 해석의 이해

NGS 검사: Whole Genome & Exome, Targeted Sequencing 비교

그러나, 언급된 내용들이 기초적이고 많이 부족하다고 느껴, 이번 포스팅에서는 타깃 시퀀싱 패널의 분석시 고려할 내용 및 팁 등을 언급해 보고자 합니다.

1) 검사 데이터의 Quality check: 사실 환자를 보는 의사의 입장에서는 최종 결과만 확인하기 때문에 가장 간과하기 쉬운 단계입니다. 그러나 본인이 직접 데이터를 분석하고 해석하고자 한다면, 가장 중요한 단계입니다. 확인해야할 여러 파라미터들이 있습니다만, 가장 기본적으로 target region의 coverage 및 depth를 확인해야합니다. 이는 우리가 검사하고자 하는 영역을 타깃 시퀀싱 패널이 얼마나 잘 디자인되어 검출하는지를 나타내주는 지표입니다. 경우에 따라 다르지만, 일반적으로 100X 이상의 depth로 원하는 영역의 99% 이상 커버(100X over target ratio > 99%)한다면 디자인이 매우 잘된 것으로 생각할 수 있습니다.

매우 잘 디자인된 타깃 시퀀싱 패널의 성능 결과 예: 평균 depth도 매우 많고, 원하는 영역을 골고루 잘 커버하는 것을 알 수 있다.

2) 검출된 변이가 true signal인가? false positive 인가?: 위와 같이 잘 디자인된 시퀀싱 패널이라 하더라도, micro-insertion 또는 deletion이 일어나는 경우에는 reference 패널과 read의 시퀀스 차이가 크기 때문에 엉뚱한 곳에 가서 read가 붙는 일이 일어날 수 있습니다. 그 결과 엉뚱한 위양성 변이가 검출되기도 합니다.

따라서 임상적으로 중요한 변이가 검출된 경우에는 (특히 frameshift mutation), 실제로 해당 변이를 IGV 와 같은 genome viewer를 통해서 직접 눈으로 확인해보는 것이 중요합니다.

국내의 모 NGS 검사 업체에서 전달받은 결과에서 보고한 한 환자의 검체에서 무더기로 검출된 변이. 검출된 변이의 빈도가 1% 정도로 매우 적기 때문에 noise signal로 판단할 수 있었지만, 이렇게 작은 빈도라 하더라도 somatic mutation을 타깃으로 하는 cancer panel이었다고 하면 이야기는 완전히 달라집니다.

경우에 따라서는 위와 같이 IGV를 통해 실제로 deletion 된 영역이 있고, read들이 올바르게 달라붙었는지를 눈으로 직접 확인해보는 것도 필요합니다.

3) 검사 목적에 따른 변이의 filter 전략: 타깃 시퀀싱 패널은 크게 2가지 유전 질환과 관련하여 생식 세포 돌연변이 (germ-line mutation) 또는 de novo mutation을 검출하거나 암 환자에서 체세포 돌연변이 (somatic mutation)을 검출할 목적으로 디자인됩니다. 이 두 가지는 구분하여 NGS 검사에서 검출된 변이를 적절하게 필터링하는 전략이 필요합니다.

<관련 포스팅 보기> 유전학 중요개념 정리: Germline vs. Somatic mutation

Germ-line의 경우에는 부모로 부터 한쌍씩 유전형을 물려받기 때문에 검출되는 변이의 상대 빈도는 ~50% 또는 ~100%일 수 밖에 없습니다. 반면, 암 세포의 경우에는 다양한 변이들이 섞여 있기 때문에 (tumor heterogeneity) 다양한 상대 빈도로 검출이 됩니다. 따라서, 변이를 필터링할 경우, 이러한 점을 염두해 두고 환자들에서 의미있는 병적 변이들을 검출하게 됩니다.

4) 집단 내 변이 빈도에 따른 filter 전략: 매우 드문 희귀 유전 질환의 변이를 검출하고자 하는 경우, 해당 변이의 집단 내 변이 빈도에 따라 필터링하는 전략도 유효합니다. 1000 Genome project 또는 ExAC과 같은 유전체 database는 인구 집단에서 해당 변이의 빈도에 대한 정보를 제공해주기 때문에, 이미 알려진 변이 빈도를 기반으로 인구 집단에서 흔하게 존재하는 변이(1% 이상)는 필터링하고 남은 변이들을 대상으로 임상적 평가를 확인하는 것이 좋습니다.

일반적으로 희귀 유전질환의 경우에는 집단 내 변이 빈도가 매우 작고, 효과 크기가 큰 변이에 의해 유발되는 것으로 생각되고 있기 때문에, NGS 검사를 통해 검출된 흔한 변이들은 크게 임상적인 의미가 없는 경우가 많습니다.

5) 유전체 데이터 베이스를 활용한 Clinical annotation: 최근 다양한 생명정보학 및 유전체 툴들이 개발되어 검출된 변이의 특성 및 정보들을 자동으로 처리해주고 있습니다. 이러한 툴들을 보조적으로 잘 활용하면 변이 판독에 소요되는 시간을 최소화하면서, 동시에 효과적으로 판정할 수 있습니다. 그러나, 경우에 따라서 이러한 판정들이 항상 옳은 것은 아니기 때문에 변이의 판정 및 판독에는 다양한 경험을 바탕으로 한 전문가의 수기 판독이 필요하게 됩니다.

가장 대표적으로 많이 사용되는 툴은 Annovar이며, annovar 내에서도 다양한 툴들이 존재하기 때문에, 사용자가 필요에 따라 이를 선택할 수 있습니다.

Annovar 홈페이지 방문하기

임상의를 위한 NGS 레포트 해석의 이해

최근에 친한 선배께서 환자의 NGS 검사 레포트를 보면서, 저에게 이것 저것 물어보는 일이 잦아졌습니다. 항상 귀찮게 해서 미안하다고 하시지만, 저의 지식이 도움이 될 수 있다는 즐거움과 이렇게 좋은 쓸 거리를 제공해주셔서, 이 자리를 빌어 감사의 말을 드립니다. 이번 포스팅은 최근 병원에서 검사 건수가 많이 늘어난 NGS 검사의 결과 레포트를 보기 위한, 기본적인 이해와 해석을 위한 지식을 포스팅해보고자 합니다.

NGS 검사는 워낙 최근에 새로 생겨난 검사이다 보니, 의사 선생님들이라 하더라도 결과 레포트 해석에 많은 어려움을 토로하고 있습니다 (의대에서 가르치지 않는 지식). 이전에 생거 시퀀싱으로 단일 유전자를 검사 하는 경우는 있었지만, 매우 드물고 검출된 변이 수가 적었기에 크게 문제가 되지 않았습니다. 그러나 NGS의 시대가 도래하면서, 환자로 부터 타깃 시퀀싱을 통해 100여개의 유전자를 한꺼번에 검사하다 보니 거기서 나오는 변이의 수도 많고, 그 임상적 의미에 대해서도 복잡하여 해석이 어려운 경우가 많습니다.

관련 포스팅 보기>

휴먼 게놈 프로젝트, 그 이후.. 그리고 정밀 의료시대까지

NGS 검사: Whole Genome & Exome, Targeted Sequencing 비교

 

HGVS (Human Genome Variation Society) nomenclature

: 유전자의 변이를 기술하는 약속입니다. 레포트가 의미하는 바를 알기위해서 기본적인 HGVS nomenclature 숙지가 필요합니다. 더 자세한 정보는 http://varnomen.hgvs.org/recommendations/general/에서 찾으시길 바랍니다.

• c.1526C>T: c는 coding sequence를 의미합니다. 즉, 어떤 유전자의 아미노산을 코딩하는 1526번째 염기가 C에서 T로 바뀌었다는 의미입니다.
• c.154-10G>T, c.194+7G>T: (-) 표시와 (+) 표시의 의미. c는 coding sequence를 나타내므로, 엑손 영역만 나타나게 됩니다. intron 영역의 염기를 표현할 때는 가장 가까운 엑손 영역의 염기를 기준으로 (-) 표시와 (+) 표시로 나타낼수 있습니다. c.154-10G>T은 154번째 코딩 유전자로부터 인트론 영역으로 10개의 bp 위쪽, c.194+7G>T는 194번째 코딩 유전자로부터 7개의 bp 아래쪽을 의미합니다.
• c.92_94del, c.92_94delGGA: coding sequence 중에 92번째부터 94번째까지 3개의 염기 (GGA)에서 결손(deletion)이 일어났다.
• c.92_94dup, c.92_94dupGGA: coding sequence 중에 92번째부터 94번째까지 3개의 염기 (GGA)가 중복(duplication)되어 나타난다.
• c.51_52insT: 51번째와 52번째 coding sequence의 사이에 T가 삽입(insertion)되었다.

 

• p.Ala132Pro, p.A132P: p는 protein을 의미합니다. 즉, 132번째 아미노산이 Ala에서 Pro으로 바뀌었다. 이 경우, missense variant에 해당합니다.
• p.Ala132=: 132번째 아미노산이 Ala이며, 아미노산에 변화가 없다. 이 경우 synonymous variant에 해당합니다.
• p.(Arg97Profs*23), p.(Arg97ProfsTer23): fs는 frame shift를 의미합니다. 즉, 프레임이 전체적으로 바뀌면서 97번째 아미노산이 Arg에서 Pro으로 바뀌고, 새로 바뀐 프레임에 의해 뒤로 23번째에 (120번째 위치) 종결 코돈 (Termination; Ter)이 나타난다는 의미입니다.

 

Variant Interpretation

• rsID (ex. rs3952537): rs는 Reference SNP을 의미합니다. 즉, reference 시퀀스를 기준으로 다른 변이에 하나의 ID를 부여했다고 할 수 있습니다. 이러한, rsID를 이용하면 해당 변이의 위치, 염색체, 해당 유전자, 인종별 분포 등 다양한 정보를 검색하기 용이합니다. 2018년 10월에 공개된 dbSNP152 database는 총 6억5천만개의 변이에 대한 정보를 제공하고 있습니다.
• 유전 정보 검색 브라우져를 통한 변이 정보 검색: 네이버나 구글과 같은 검색 툴처럼 유전 정보에 대한 검색 툴도 많이 개발되어 있습니다. 대표적으로 Ensemble Genome browser, ExAC browser, UCSC browser 등이 있습니다. 해당 홈페이지에서 위의 rsID를 이용하면, 다양한 추가적인 정보를 얻을 수 있습니다. 저는 개인적으로 VarSome 이라는 사이트가 보기 편해서, VarSome을 주로 이용하고 있습니다.

 

 

ACMG 가이드라인에 따른 변이의 5단계 분류. 결과 보고지에는 보통 VUS 이상의 변이가 포함됩니다.

• ACMG Classification: Pathogenic, Likely Pathogenic, VUS (Variant of Uncertain Significance) – ACMG (American College of Medical Genetics)라는 단체에서 정한 변이 분류 기준에 따라 해당 변이를 분류한 것입니다.
• VUS : 쉽게 말해, 해당 변이의 의미를 정확히 모르겠다. 라고 생각하면 됩니다. ‘아직까지 명확한 임상적 증거가 없는, 잘 모르겠는 애매한 변이입니다’ 라는 뜻으로 해석하시면 됩니다. 사실 질병과 변이의 관계가 명확하게 밝혀진 것은 전체 변이의 1% 정도 밖에 되지 않습니다. 때문에, 대부분의 변이가 VUS로 분류될 수 밖에 없습니다.
• In silico tool score – SIFT, PolyPhen-2 등등: 아미노산의 치환에 의해 단백질 구조와 기능이 영향을 받을지 예측하는 컴퓨터 알고리즘이 100개 이상 존재합니다. 시퀀싱 레포트에서 종종 추가적으로 이러한 툴을 이용하여 예측한 해당 변이의 기능 정보를 추가하고 있습니다. SIFT는 0에 가까울수록, PolyPhen-2는 1에 가까울수록 문제가 있는 병적 변이일 가능성이 높다고 예측합니다. 다만 이러한 정보는 참고를 위한 정보이기 때문에, 진료를 위해 활용하기는 어렵습니다.

 

변이 빈도가 중요한 이유는, 드문 변이일수록 형질에 영향을 더 크게 미칠 확률이 높아지기 때문입니다.

• Allele frequency: 해당 변이의 일반 인구 집단에서의 분포 빈도를 나타냅니다. 보통 1% 미만의 변이를 rare variant, 그보다 큰 경우는 common variant로 분류합니다. 변이 빈도가 중요한 이유는 rare variant 일수록, effect size가 커서 실제 병적 변이로 의심해봐야할 가능성이 높아지기 때문입니다. 그러나 변이 빈도를 산출해낸 인구 집단의 크기와 조성(ExAC, gnomAD 등)에 따라, 인종 및 성별에 따라 변이 빈도는 천차 만별인 경우도 많음을 유의해야합니다. 우리 나라에서는 대규모 한국인에서의 변이 빈도를 참고하는 것이 좋겠지만, 아쉽게도 한국인의 인구 집단 데이터 (KRGDB, KOVA 등)는 아직 크기가 작아서 참고용으로 많이 사용되고 있습니다.
• Inheritance pattern – AD (Autosomal Dominant, 상염색체 우성), AR (Autosomal Recessive, 상염색체 열성), XD (X-linked Dominant, X 염색체 우성), XR (X-linked Recessive, X 염색체 열성) 등의 대표적 멘델 유전 양식을 나타냅니다.

• De novo variant란? (라틴어로 de novo는 ‘of new’를 의미) 즉, 부모로부터 유전되지 않고, 정확한 원인을 모르지만 환자에서 새로이 나타난 변이를 일컫습니다. 환자에서 De novo variant가 있는 경우에는 환자의 질병의 원인이 되는 변이로 의심해볼 가능성이 높아집니다. 이런 경우에는 부모로부터 유전되었는지, de novo 인지를 확인하기 위해 유전 상담 및 부모의 가족 검사를 추천하기도 합니다.

 

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바이오 연구자를 위한 Genome Browser 비교 및 활용

NGS 결과의 임상 적용: Genotype-phenotype correlation

아미노산 치환의 효과 예측: In silico tool의 원리와 종류

[유전학 중요개념 정리] De novo mutation의 발생 기전과 질병 발생학적 의의

 

Conclusion: 음.. 어떻게 해석할까?

임상 선생님들은 간결하고 명확한걸 좋아합니다. 하지만 생각보다 변이와 질병 관계가 명확한게 별로 없고 모르는게 많습니다. 그러다보니 검출된 변이는 많이 보고하지만, 그에대한 해석은 결국 환자의 임상 증상에 맞게 통합적으로 내릴수 밖에 없습니다. 이 부분은 임상의의 경험과 안목이 필요합니다. 일반적으로 이러한 과정을 Genotype-Phenotype correlation (유전형-표현형 일치) 라고 하는데, 현재도 많은 연구자들이 이 관계를 밝히기 위해 노력하고 있습니다.

 

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[References]

Richards, Sue, et al. “Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology.” Genetics in medicine 17.5 (2015): 405-423.

Rehm, Heidi L., et al. “ACMG clinical laboratory standards for next-generation sequencing.” Genetics in medicine 15.9 (2013): 733-747.