[NGS DNA-SEQ] Functional Equivalence pipeline: CROMWELL, WDL

gnomAD, TOPMed 등 대규모 유전체 코호트들이 만들어지면서, 여기서 생산된 데이터를 이용하는데 중요한 문제가 부각되었는데, 바로 분석 결과 간의 재현성호환성에 있었습니다. 즉, 연구자가 GATK Best practice를 이용하여 Exome 또는 Genome 시퀀싱 분석을 진행하더라도 어떤 설정과 파라미터 값을 넣느냐에 따라, 최종 검출 변이의 결과가 달라지고, 이것은 연구 결과 간의 재현성의 측면에서 매우 중요한 문제가 되었던 것이지요. 참고논문에서 진행한 실험 결과를 보면, 동일한 샘플로 생산된 FASTQ 파일을 서로 다른 5개의 기관에 보내 각각의 파이프 라인으로 분석한 결과, Call된 변이들 간에 많은 차이가 있었다고 보고하고 있습니다.

[관련 포스팅 보기]

따라서, 점점 늘어나는 유전체 데이터만큼 유전체 분석 파이프 라인을 하나의 표준화된 파이프 라인으로 통합하는 것이 매우 중요해졌고, 그 결과 개발된 것이 “Functional Equivalence (FE)” Pipeline (기능적으로 동등한 파이프라인) 입니다. 사실 NGS 분석을 하는 사용자의 입장에서는 Input만 넣고, Output만 나오면 편한데, 그동안 개발된 툴들은 이를 모두 아우르는 것이 아니라, 그때 그때마다 필요한 부분들을 개발했기 때문에, 분석 파이프 라인도 이제야 어느 정도 성숙 단계에 이르렀다고 할 수 있습니다. 따라서 최근의 대규모 유전체 컨소시엄들은 모두 “Functional Equivalence ” Pipeline 을 통해 생산된 유전체 데이터를 생산하는 것으로 채택하고 있습니다. (그래서 저도 functional equivalent한 결과를 얻기 위해서 최근에 새롭게 공부를 하게 되었습니다.)

[ Functional Equivalence Pipeline Overview]

FE 파이프라인을 제공하기 위해서, Broad Institute의 개발진들은 WDL (Workflow Description Langauge)과 Cromwell이라고 하는 프로그래밍 언어를 개발하는데, 하나의 파이프라인을 패키지로 묶은 WDL 파일을 만들고, 이를 Cromwell이라는 프로그램으로 구동시켜주는 원리라고 합니다. 사실 사용자의 입장에서는 과거에 개별 프로그램을 설치하고, 개별 스텝을 따로 돌려야했다면, 지금은 이러한 것들이 모두 하나의 패키지 형태로 제공되기에 더욱 편해졌다고 할 수 있습니다 (?).

[Cromwell 페이지 바로 가기] https://cromwell.readthedocs.io/en/stable/

[WARP 페이지 바로가기] https://broadinstitute.github.io/warp/docs/get-started/

Cromwell의 로고: 꼬마돼지 베이브와 스타트렉에 출연한 배우 James Cromwell을 오마주한 로고라고 합니다 🙂

병원 검사실을 운영하는데, 검사 장비와 보고 방법을 표준화하는 것은 매우 중요한데, 유전체 분석 파이프 라인에도 이제야 이러한 개념이 들어왔다는 점이 반갑습니다. (분석 파이프 라인 하나도 이렇게 표준화하기가 어렵습니다.) Genome의 경우에는 처리해야할 데이터의 크기가 워낙 방대하기때문에 더욱 어려운 점이 있는 것 같습니다. 현재 이쪽 분야도 많은 Computational Scienctist들이 뛰어들어서 개발을 진행하고 있는 중이기 때문에, 추후에 더 User-friendly하고 간편한 파이프 라인이 개발되어 제공되기를 기대해 봅니다. (점차 대세는 클라우드로 옮겨가지 않을까 합니다?)

[References]

Regier, Allison A., et al. “Functional equivalence of genome sequencing analysis pipelines enables harmonized variant calling across human genetics projects.” Nature communications 9.1 (2018): 1-8.

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암유전체 분석: Driver mutation prediction tools

이전 포스팅에서 암에서 발생하는 mutation을 driverpassenger로 구분하는 개념에 대해서 언급했습니다. 이번에는 실제로 시퀀싱을 진행했을 때 검출되는 많은 변이들을 실제 암 발생의 driver와 passenger를 구분하는 방법과 다양한 툴들에 대해서 정리해 보고자합니다.

관련 포스팅 보기>

[유전학 중요개념 정리] Driver vs. Passenger mutation in cancer

[유전학 중요개념 정리] Mutational signature

사실 Somatic mutation이나 Germline mutation이나 질병 발생의 원인 유전자와 변이를 찾는 방법이라는 데에서 큰 틀의 접근 방법은 동일합니다.  Germline 변이를 판독하는 큰 틀을 제시하는 가이드라인이 ACMG guideline이라고 한다면, Cancer 변이 판독의 기준으로는 흔히 AMP/ASCO/CAP guideline의 Tier system이 사용되고 있습니다. 즉, 개별 변이들을 아래와 같이 증거 수준과 임상적 중요도 등에 따라 Tier 1~4로 구분을 하여, 중요도가 높은 변이들을 임상적으로 활용하는 것이지요. 하지만, 이 역시도 한계가 많고 구분도 모호하기 때문에, 실질적으로 검출된 변이들의 driver mutation을 예측할 수 있는 다양한 툴들이 개발되고 있습니다.

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[Somatic variant 변이 판독을 위한 AMP/ASCO/CAP guideline에 따른 Tier classification]
 

NGS를 시행하게 되면, 다양한 변이들이 쏟아져 나오게 됩니다. 이때 해당 변이의 판독은 크게 아래와 같은 접근법을 이용하게 됩니다.

  1. 기존의 암에서 자주 보고된 알려진 변이인가? Database에 이미 널리 알려진 변이 (매우 소수)
  2. Database에 등록 되어 있지는 않지만, 정상 인구 집단에서는 관찰되지 않는 매우 드문 변이인가? (Population genetics 관점에서 allele frequency)
  3. 여러가지 in-silico prediction tool이 해당 변이의 deleterious effect를 예측하고 있고, 해당 변이가 단백질의 매우 중요한 3차원적 위치에 있는 경우 (Mutational hot-spot, Functional genetics 관점에서 protein의 기능 및 domain)

 

이러한 접근법에 근거하여 다양한 tool들이 개발되고 있으며, 대표적으로 널리 쓰이는 몇가지 tool들을 소개하며, 이번 포스팅은 마치고자 합니다. NGS 검사를 통해 검출된 변이에 아래의 DB에서 제공하는 다양한 정보를 annotation하고, 이에 근거하여 driver mutation을 예측하게 됩니다.

I. COSMIC (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic)

Wellcome Sanger Institute에서 제공하고 있는 암 유전체 관련 DB입니다. 보통 개별 변이마다 DB에 등록되면서 COSMIC ID가 부여되는데, 가장 방대한 DB를 구축하고 있어서 새로운 변이들을 확인할 때 가장 먼저 살펴보게 되는 DB입니다.

 

II. cBioPortal (http://www.cbioportal.org/)

다양한 암종과 TCGA cancer genome 데이터를 기반으로 하여, 보고된 다양한 mutation에 대한 정보들을 제공하고 있습니다. 대표적이고 유명한 paper들에 사용된 cancer genome DB를 포함하고 있고, 실제 유전자들의 functional domain과 hot-spot 정보들을 함께 제공하고 있어서 유용하게 이용할 수 있는 DB입니다.

 

III. OncoKB (https://oncokb.org/)

Memorial Sloan Kattering Cancer Center에서 구축한 DB로 조금 더 임상적으로 중요한 변이들이 명확하게 curation 되어 있습니다. 임상적으로 중요하고 근거 수준이 명확한 변이들을 Level에 따라서 잘 정리한 장점이 있으나, 변이 데이터는 상대적으로 조금 빈약한 편입니다.

 

IV. Cancer Genome Interpreter (https://www.cancergenomeinterpreter.org)

이미 구축된 다양한 DB와 기존 논문 보고 데이터들을 통합하여, 변이들의 driver mutation 여부를 종합적으로 잘 판독해주는 툴로 유용하게 사용할 수 있습니다. 다만, 프로그램이 공개되어 있지 않고 서버에 직접 본인의 데이터를 업로드하여야 하고 한번에 업로드할 수 있는 변이의 수가 5,000개로 제한되어 있는 점은 단점이라고 할 수 있습니다.

 

V. MutaGene (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/research/mutagene/)

가장 최근에 개발된 tool로 Python package도 제공되어 있어, 따로 서버에 자료를 올리지 않고 설치해서 바로 사용할 수 있는 장점이 있습니다. Driver mutation 예측 외에도 Mutational signature 분석도 함께 할 수 있어서, 유용한 정보를 제공하고 있습니다.

 

위의 내용을 살펴보면, 아직까지 완벽한 변이 판독 방법은 없구나 하는 것을 느끼게 됩니다. 사실 이전에 약물 유전자와 관련된 연구에 대해 포스팅 했었는데, 비슷한 연구가 암 관련 유전자에 대해서도 함께 진행 중입니다. 따라서 최근의 연구 추세는 다양한 변이의 임상적 판독을 위한 충분한 정보를 제공할 수 있는 대용량 변이 판독 방법에 집중되고 있으며, Functional genomics 분야의 큰 부분을 차지하며 연구비가 몰리고 있는 상황입니다.

관련 포스팅 보기>

약물유전체 정밀의료의 실현, F-CAP 프로젝트

유전자 변이의 해석: 대용량 기능 검사의 필요성

 

[References]

Li, Marilyn M., et al. “Standards and guidelines for the interpretation and reporting of sequence variants in cancer: a joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology, American Society of Clinical Oncology, and College of American Pathologists.” The Journal of molecular diagnostics 19.1 (2017): 4-23.