우리가 흔히 차세대 염기 서열 시퀀싱이라고 부르는 NGS 기술에서 가장 현실적으로 중요한 요소는 아직까지는 ‘비용 (cost)’일 것입니다. 시퀀싱 비용이 점점 떨어지고 있기는 하지만, 여전히 가격대비 효율성을 고려할 때 임상적인 목적으로는 질병 특이적인 타겟 패널 시퀀싱 (Targeted panel Sequencing)을, 그리고 연구용으로 이용할 때는 엑솜 시퀀싱 (Whole Exome Sequencing)을 주로 이용하고 있습니다. 타겟 패널 시퀀싱과 엑솜 시퀀싱은 시퀀싱 과정에서 게놈 시퀀싱과는 다른 점이 있는데, 바로 Target enrichment 과정의 유무입니다. 그래서 이번 포스팅은 시퀀싱 과정 중 Target enrichment 방법과 원리, 그리고 각 방법별 장단점을 정리해보고자 합니다.
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게놈 시퀀싱과 달리 엑솜 시퀀싱을 포함하는 타겟 시퀀싱은 전체 유전체의 매우 적은 부분을 시퀀싱하는 방법입니다. (참고로 엑솜 영역은 전체 유전체의 2~3% 미만입니다.) 따라서, 원하는 해당 부위만 특이적으로 capture를 해야합니다. 즉, 엉뚱한 부위에 가서 프로브가 붙어서 시퀀싱 데이터를 생산하면 안된다는 소리입니다. 이를 위해서는 타겟으로 하는 영역을 적절하게 검출하고 분리하는 방법이 필요한데, 민감도와 특이도를 모두 높히기 위해 일반적으로 Target enrichment (타겟 영역만 선택적으로 분리하여 증폭시키는 방법) 과정이 포함되어 있습니다.
Target enrichment는 크게 아래와 같은 3가지 방법들이 사용되고 있습니다.
1) Hybrid capture 방법, 2) Selective Circularization 방법, 3) PCR 기반 Amplicon 방법
Hybrid capture는 타겟 영역에 특이적인 capture probe로 구성되어 원하는 부분만 caputre하는 방법이고, Circularization 방법은 probe가 circle 형태로 달라 붙어 원하는 부위를 증폭한 후에 연결하는 방법입니다. 마지막으로 Amplicon 방법은 원하는 타겟 영역을 PCR로 증폭시켜서 분석하는 방법에 기반합니다. 이 때 catpure 방법의 가장 중요한 요소는 크게 아래와 같습니다.
- Sensitivity: 얼마나 민감하게 원하는 타겟 영역들을 잘 검출할 수 있는가?
- Specificity: 타겟 영역 특이적으로 검출이 되는가? = 타겟 영역 이외의 영역 (Off-target)을 증폭하거나 검출하지는 않는가?
- Coverage uniformity: 다수의 타겟 영역을 증폭할 때, 모든 타겟 영역들이 bias 없이 고르게 증폭되는가? > 특정 영역만 depth가 낮게 증폭된다면 해당 영역을 검출하는데 문제가 됩니다.
가장 대표적인 Hybrid capture와 Amplicon 방법의 장단점을 정리하면 아래와 같습니다. 다만, 요즘 추세는 대부분 Hybrid capture 방법으로 가고 있는 것 같습니다. Hybrid capture 방법의 단점으로는 상대적으로 DNA 검체량이 조금 더 많이 필요하고, 좀 더 작업 과정이 복잡하여 까다롭다는 점을 들 수 있겠습니다. 따라서 최근 개발되는 엑솜 시퀀싱 capture 패널은 대부분 이러한 단점들을 개선하여 요구되는 검체 최소량을 줄이고, 전체 엑손 영역을 고르게 검출할 수 있다는 점을 부각시킨 제품들로 출시가 되고 있습니다.
[Reference]
마지막으로 비록 조금 오래된 영상이기는 하지만, 슬라이드 정리가 잘 된 유투브 영상이 있어 첨부합니다.
두마디 정밀의료 