Exome sequencing을 위해 고려할 요소들: capture kit와 target coverage 선택

Exome (엑솜)이란 유전자의 exon 영역을 모두 포함하는 집합체를 말합니다. 최근 가격적으로 시퀀싱 비용이 많이 떨어지면서, 연구 목적의 엑솜 시퀀싱이 광범위하게 사용되고 있는 것 같습니다. 사실 시퀀싱 이후의 데이터 분석도 중요한 과정이긴 하지만, 많은 사람들이 간과하고 있는 것이 그보다 상위 단계에 있는 시퀀싱 데이터 생산 계획 과정입니다. 여기서 말하는 시퀀싱 데이터 생산 계획이라 함은, 목적에 맞는 적절한 시퀀싱 장비 선정, 엑솜 키트 선택, 적절한 target coverage depth 선정 등을 모두 포함합니다.

Overview-of-whole-exome-sequencing-pipeline-SNV-single-nucleotide-variant

Whole exome 은 일반적으로 모든 exon 영역을 지칭하지만, 사실 아직까지도 전체 유전자의 정체(?)를 정확히 모르고 있는 시점에서 논란이 많이 남아있는 부분이 있습니다. 일반적으로 시퀀싱 장비는 Illumina 사의 장비가 가장 보편적으로 이용되고 있기 때문에 차치하고라도, 유전체 (genome)에서 Exome 부분만 capture 하는데 사용되는 키트도 아래와 같이 다양한 제품이 존재합니다. 아래의 표에서 가장 눈여겨 볼 부분은 Target Region의 크기인데, 일반적으로 Exome이라고 말하는 부분의 크기도 39 ~ 64 Mb로 차이가 나는 것을 볼 수 있습니다. 이는 여러가지 기술적인 이유로 타겟 영역을 서로 다르게 디자인한 부분과 엑손 영역의 타겟 유전자의 수도 차이가 있기 때문입니다.

관련 포스팅 보기>

NGS Target enrichment method: Hybridization vs. Amplicon capture

NGS 검사: Whole Genome & Exome, Targeted Sequencing 비교

Exome kit.jpg

시장의 선두 주자는 A사 였으나, 최근에 많은 회사에서 경쟁적으로 capture 효율과 coverage 를 개선시킨 저렴한 가격의 kit를 개발하여 공급하고 있습니다. I사의 경우에는 UK Biobank의 Exome sequencing에 이용되어, 호환성에서 장점이 있습니다. 사실 서로의 제품이 더 좋다고 광고하는 상황에서 Exome capture kit 선택은 쉽지 않지만, 최소 DNA 요구량, 관심이 있는 주요 유전자에서의 Coverage 정도, 그리고 가격 등의 요소를 종합적으로 고려하여 최적의 키트를 선택하는 것이 좋습니다. 제품마다 유전자별로 cover 되는 효율에 차이가 있는데, 특히나 관심이 있는 유전자들이 잘 cover 되지 않는 제품이라면, 검체에서 해당 변이를 검출하는 민감도에 큰 차이를 보일 수 있습니다. 특히나 낮은 수준으로 존재하는 종양의 변이들을 검출하는 연구 목적의 검사에서는 변이 검출 유무의 중요한 요소로 작용할 수도 있기 때문입니다.

일반적으로 시퀀싱 비용은 생산되는 데이터의 크기에 비례하여 증가하게 됩니다. 이때, 타겟 영역의 크기캡쳐 키트의 효율, 그리고 원하는 Coverage depth를 이용하면, 대략적으로 필요한 시퀀싱 데이터의 크기를 계산할 수 있습니다. 예를 들어, 위 표의 Agilent SureSelect V6 Exome kit를 이용하여, 100×의 depth로 시퀀싱을 하고 싶다고 가정하고, 일반적인 target capture 효율 (0.6 ~ 0.7)을 적용해봅시다. 아래 계산에 의해 총 10Gb의 데이터를 생산해야 원하는 coverage를 달성함을 계산할 수 있습니다.

(시퀀싱 데이터 크기) = (타겟 영역의 크기) × (Depth) / (On-target ratio)

(시퀀싱 데이터 크기) = 60 Mb × 100 / 0.6 = 10 Gb

 

시퀀싱을 위한 총 비용은 위 표의 capture kit 가격과 생산되는 데이터의 크기, 그리고 이용되는 시퀀싱 장비 및 검체 처리에 사용되는 시약의 가격 등이 합쳐져서 결정됩니다. 이 중에서 이용자가 결정할 수 있는 부분은 capture kit의 종류전체 시퀀싱 데이터의 크기 이기 때문에, 위의 내용들을 잘 숙지하여 필요한 만큼의 데이터를 효율적으로 생산하는 것이 중요합니다. 위의 내용은 Genohub의 Whole Exome Sequencing Guide의 내용을 정리한 것입니다. 마지막으로, 위에서 언급한 내용들을 정리하면서, 포스팅을 마치도록 하겠습니다.

Considerations for Whole Exome Sequencing

1. What sequencing instrument and read length should I choose for exome-seq?
2. How much sequencing coverage do I need for exome sequencing?
3. How do I calculate the sequencing coverage or depth required for my whole exome sequencing study?
4. Which exome sequencing capture kit should I use for my study?
5. How can I compare the annotation and exome capture design between each kit?

 

[Reference]

Genohub: Whole Exome Sequencing Guide

Goh, Gerald, and Murim Choi. “Application of whole exome sequencing to identify disease-causing variants in inherited human diseases.” Genomics & informatics 10.4 (2012): 214.

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NGS 데이터를 이용한 CNV 분석

Copy Number Variation (CNV)는 Single Nucleotide Variation (SNV)과 더불어, 유전적 다양성을 나타내는 주요한 원인으로 생각되고 있습니다. 유전자 sequence의 염기 하나가 치환된 SNV와 달리 CNV는 유전자 전체 또는 일부의 copy가 중복되거나 줄어들수도 있기 때문에 훨씬 넓은 영역에서 나타나는 Structural variation의 일종입니다.

관련 포스팅 보기 -> 유전학 중요개념 정리: Structural variation 및 Copy-number variation

일반적으로 NGS는 SNV를 보기 위한 목적으로 검사를 시행하지만, 해당 데이터를 활용하면 CNV 분석도 할 수 있기 때문에, 오늘은 NGS 데이터를 활용한 CNV 분석 방법에 대해 포스팅하고자 합니다.

NGS CNV
[그림1. NGS 데이터를 이용하여 CNV를 검출하는 원리] CNV 검출을 위해서는 mapping 되는 read 간의 정보, 그리고 각 영역에 mapping된 read의 depth 정보를 활용하게 됩니다.

위의 그림은 CNV 분석을 위한 NGS 데이터의 5가지 활용 원리를 나타내주고 있습니다. 그러나 가장 핵심이 되는 원리는 Read depth입니다. Target sequencing과 같이 Read depth가 충분한 경우에, 다른 검체들에 비해 해당 영역의 depth가 월등히 떨어지거나, 또는 월등히 높은 경우에는 해당 영역의 deletion 또는 duplication을 의심할 수 있습니다.

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[그림2. FGFR2 유전자의 Coverage (위) 및 Reference의 depth로 normalized한 depth (아래)를 나타내는 도표] 다른 검체들보다 Normalized depth가 월등히 높은 검체 (P27)는 해당 영역의 duplication, 월등히 낮은 검체 (P33)는 해당 영역의 deletion이 존재하는 것으로 의심할 수 있다.

사실 NGS 데이터는 CNV를 목적으로 한 것이 아니라, SNV 검출 목적의 데이터를 부수적으로 활용하는 것이기 때문에 많은 제한점이 있습니다. 따라서, 임상적으로 CNV 검사 목적의 NGS는 권장되지 않으며 적절한 가이드라인도 존재하지 않기 때문에 다양한 Computational tool 들이 개발되어 서로의 장점을 홍보하는 상황입니다. 다음은 다양하게 개발된 대표적인 CNV 검출 tool 들을 정리한 표입니다. 많은 경우  BAM 파일을 활용하는 것을 볼 수 있으며 대부분 R package를 제공하고 있어, 사용이 용이합니다.

NGS CNV2
[그림 3. CNV 검출을 위한 다양한 컴퓨터 툴] 어떠한 툴이 우수한가에 대해서는 명확하게 정립된 결론이 없기 때문에, 적절한 상황에 맞게 툴들을 활용하는 것이 필요합니다.
위의 표와 같이 다양한 툴들이 존재하지만, 실제로 몇가지 툴들을 사용하여 봤을 때, 결과들이 제각각이었고, 서로 일치하는 정도도 높지 않았습니다.  다양한 알고리즘을 활용함에도 불구하고, 위양성으로 보고되어 믿기 어려운 경우가 많았습니다. 가장 정확한 방법은 직접 그림 2와 같이 해당 영역의 coverage plot과 normalized depth를 보고 종합적으로 판단하는 것이었습니다. 아직까지 컴퓨터 툴들에 개선의 여지가 많음에도 불구하고, NGS 데이터를 활용하면 CNV에 대한 정보도 일부 얻을 수 있기 때문에 NGS는 더 폭넓게 활용될 것으로 전망이 됩니다.

[Reference]

Zhao, Min, et al. “Computational tools for copy number variation (CNV) detection using next-generation sequencing data: features and perspectives.” BMC bioinformatics 14.11 (2013): S1.

NGS 타깃 시퀀싱 패널 검사의 분석 및 해석시 고려할 사항

지난 포스팅에서는 임상의의 입장에서 NGS 검사를 통한 변이의 해석을 이해하기 위한 기초적인 내용들을 언급했습니다.

<관련 포스팅 보기>

임상의를 위한 NGS 레포트 해석의 이해

NGS 검사: Whole Genome & Exome, Targeted Sequencing 비교

그러나, 언급된 내용들이 기초적이고 많이 부족하다고 느껴, 이번 포스팅에서는 타깃 시퀀싱 패널의 분석시 고려할 내용 및 팁 등을 언급해 보고자 합니다.

1) 검사 데이터의 Quality check: 사실 환자를 보는 의사의 입장에서는 최종 결과만 확인하기 때문에 가장 간과하기 쉬운 단계입니다. 그러나 본인이 직접 데이터를 분석하고 해석하고자 한다면, 가장 중요한 단계입니다. 확인해야할 여러 파라미터들이 있습니다만, 가장 기본적으로 target region의 coverage 및 depth를 확인해야합니다. 이는 우리가 검사하고자 하는 영역을 타깃 시퀀싱 패널이 얼마나 잘 디자인되어 검출하는지를 나타내주는 지표입니다. 경우에 따라 다르지만, 일반적으로 100X 이상의 depth로 원하는 영역의 99% 이상 커버(100X over target ratio > 99%)한다면 디자인이 매우 잘된 것으로 생각할 수 있습니다.

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매우 잘 디자인된 타깃 시퀀싱 패널의 성능 결과 예: 평균 depth도 매우 많고, 원하는 영역을 골고루 잘 커버하는 것을 알 수 있다.

2) 검출된 변이가 true signal인가? false positive 인가?: 위와 같이 잘 디자인된 시퀀싱 패널이라 하더라도, micro-insertion 또는 deletion이 일어나는 경우에는 reference 패널과 read의 시퀀스 차이가 크기 때문에 엉뚱한 곳에 가서 read가 붙는 일이 일어날 수 있습니다. 그 결과 엉뚱한 위양성 변이가 검출되기도 합니다.

따라서 임상적으로 중요한 변이가 검출된 경우에는 (특히 frameshift mutation), 실제로 해당 변이를 IGV 와 같은 genome viewer를 통해서 직접 눈으로 확인해보는 것이 중요합니다.

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국내의 모 NGS 검사 업체에서 전달받은 결과에서 보고한 한 환자의 검체에서 무더기로 검출된 변이. 검출된 변이의 빈도가 1% 정도로 매우 적기 때문에 noise signal로 판단할 수 있었지만, 이렇게 작은 빈도라 하더라도 somatic mutation을 타깃으로 하는 cancer panel이었다고 하면 이야기는 완전히 달라집니다.
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경우에 따라서는 위와 같이 IGV를 통해 실제로 deletion 된 영역이 있고, read들이 올바르게 달라붙었는지를 눈으로 직접 확인해보는 것도 필요합니다.

3) 검사 목적에 따른 변이의 filter 전략: 타깃 시퀀싱 패널은 크게 2가지 유전 질환과 관련하여 생식 세포 돌연변이 (germ-line mutation) 또는 de novo mutation을 검출하거나 암 환자에서 체세포 돌연변이 (somatic mutation)을 검출할 목적으로 디자인됩니다. 이 두 가지는 구분하여 NGS 검사에서 검출된 변이를 적절하게 필터링하는 전략이 필요합니다.

<관련 포스팅 보기> 유전학 중요개념 정리: Germline vs. Somatic mutation

Germ-line의 경우에는 부모로 부터 한쌍씩 유전형을 물려받기 때문에 검출되는 변이의 상대 빈도는 ~50% 또는 ~100%일 수 밖에 없습니다. 반면, 암 세포의 경우에는 다양한 변이들이 섞여 있기 때문에 (tumor heterogeneity) 다양한 상대 빈도로 검출이 됩니다. 따라서, 변이를 필터링할 경우, 이러한 점을 염두해 두고 환자들에서 의미있는 병적 변이들을 검출하게 됩니다.

4) 집단 내 변이 빈도에 따른 filter 전략: 매우 드문 희귀 유전 질환의 변이를 검출하고자 하는 경우, 해당 변이의 집단 내 변이 빈도에 따라 필터링하는 전략도 유효합니다. 1000 Genome project 또는 ExAC과 같은 유전체 database는 인구 집단에서 해당 변이의 빈도에 대한 정보를 제공해주기 때문에, 이미 알려진 변이 빈도를 기반으로 인구 집단에서 흔하게 존재하는 변이(1% 이상)는 필터링하고 남은 변이들을 대상으로 임상적 평가를 확인하는 것이 좋습니다.

변이빈도와 효과 크기
일반적으로 희귀 유전질환의 경우에는 집단 내 변이 빈도가 매우 작고, 효과 크기가 큰 변이에 의해 유발되는 것으로 생각되고 있기 때문에, NGS 검사를 통해 검출된 흔한 변이들은 크게 임상적인 의미가 없는 경우가 많습니다.

5) 유전체 데이터 베이스를 활용한 Clinical annotation: 최근 다양한 생명정보학 및 유전체 툴들이 개발되어 검출된 변이의 특성 및 정보들을 자동으로 처리해주고 있습니다. 이러한 툴들을 보조적으로 잘 활용하면 변이 판독에 소요되는 시간을 최소화하면서, 동시에 효과적으로 판정할 수 있습니다. 그러나, 경우에 따라서 이러한 판정들이 항상 옳은 것은 아니기 때문에 변이의 판정 및 판독에는 다양한 경험을 바탕으로 한 전문가의 수기 판독이 필요하게 됩니다.

가장 대표적으로 많이 사용되는 툴은 Annovar이며, annovar 내에서도 다양한 툴들이 존재하기 때문에, 사용자가 필요에 따라 이를 선택할 수 있습니다.

Annovar 홈페이지 방문하기

[유전학 중요개념 정리] Germline vs. Somatic mutation

가끔 주위 선생님들과 NGS 검사를 통해 발견된 변이에 대해서 이야기를 할 때, Germ-lineSomatic mutation, 두 가지 개념의 차이를 잘 모르는 경우를 종종 보아와서, 이번 포스팅에서는 Germline mutation (생식 세포 돌연변이)Somatic mutation (체세포 돌연변이)의 개념과 임상적 중요성에 대해서 정리하려고 합니다. 생식 세포 돌연변이와 체세포 돌연변이는 크게 2가지 개념에서 구분할 수 있습니다.

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  1. Inheritance: 부모로부터 물려받은 변이인가? 살아가면서 새로 발생하고 축적된 돌연변이 인가?
  2. Mosaicism: 개체의 모든 세포들이 공유하는 변이인가? 특정 세포에만 발생된 변이인가?

우리의 몸은 처음에는 하나의 세포에서 기원했지만, 장기나 조직 별로 각 세포를 구성하고 발현하는 유전체는 동일하지 않습니다. 임상적인 관점에서 위의 2가지 구분은 대상 질환의 검사 방법 및 분석 방법에도 차이를 발생시킵니다. 가령, 부모로 부터 물려받은 유전 질환에 대해서 검사하고 싶다면 Germ-line mutation을 target으로 해야하고, 어떤 암 환자 조직에서 발생한 mutation을 검사하고 싶다면 Somatic mutation을 target으로 해야 합니다. (물론 Cancer의 경우에도 생식세포에서 발생하는 Germ-line mutation이 중요한 Hereditary cancer syndrome의 경우도 있긴 합니다만, 대부분의 일반 장기에서 발생하는 경우 Somatic mutation이 주요 원인입니다.)

특히 암의 경우에는 조직을 구성하는 세포들이 정상 세포와 암세포간에 Mosaicism을 이루고, 같은 암세포라 하더라도 가지고 있는 돌연변이들이 모두 다릅니다. 이를 Tumor Heterogeneity (종양 이질성) 라고 부릅니다.

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같은 종양 조직 안에서도 무수히 많은 종양세포 군집이 뒤섞여 있습니다. 이를 Tumor Heterogeneity라고 부릅니다.

그렇다면, 위의 구분이 검사에서 왜 중요할까요? NGS 검사를 통해서, 암의 원인이 되는 변이를 찾고자 한다고 가정해보겠습니다. 그리고 암 환자의 조직을 수술을 통해서 검사를 보냈다고 가정해 봅시다. 보통은 조직에서 DNA를 추출하고, DNA 절편을 만들어서 NGS 검사를 진행합니다. 그리고 기기에서는 각 절편을 기준이 되는 Reference Genome에 Assembly를 구성해서, 환자의 Sequence를 읽게 됩니다.

이때 Depth of Coverage라는 개념이 있게 되는데, 어느 한 지역을 얼마나 많은 절편으로 읽었는가? 하는 개념이 됩니다. 즉, Depth가 깊을수록, 그 지역의 누클레오타이드는 더 확실하고 명확하게 됩니다. 그런데 간혹 기기에서 시퀀싱 에러가 발생하는 경우도 있게 됩니다. 만약 한번의 시퀀싱 에러가 발생했는데, 그 부위의 depth가 2라면, Error rate는 50%가 되지만, depth가 200이라면 Error rate는 0.5%가 됩니다. 그런데 암세포의 변이를 찾는 검사에서 돌연변이가 전체 조직 세포의 5%에만 존재한다고 생각해 봅시다. 이 변이를 검출하기 위해서는 적어도 depth가 20은 되어야 1개의 변이가 나타날 것입니다. 그런데 depth가 20일때, 이러한 변이가 검출되었다면 이것이 에러인지 진짜인지 어떻게 알 수 있을까요? 그래서 Somatic mutation을 검출하는 검사는 일반적으로 더 높은 Read Depth를 요구합니다. (이를 위해 Deep sequencing이 요구되며, 일반적으로 500~1,000X 이상으로 읽게 됩니다. 임상적으로 Germline 이 target인 경우는 더 적은 depth로도 충분하게 됩니다.)

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NGS 검사의 특성상 위치별로 Coverage 및 Depth가 다르게 되며, 이는 SNP 검사 결과의 신뢰도와 error rate 등에 영향을 주게 됩니다.

반대로 Germ-line mutation을 target으로 변이를 검출하려고 한다고 생각해봅시다. 그런데 어느 부위에서 A가 10번, T가 90번 읽혔습니다. 그러면 이 변이는 Somatic mutation 또는 시퀀싱 에러의 가능성이 매우 높기 때문에 분석에서 제외하는게 좋습니다. 왜냐하면 Germ-line은 부모로 부터 물려받았기 때문에 Homozygete 또는 Heterozygote의 2가지 경우만 있을 것이고, SNP을 읽었을 때 50:50으로 읽히거나 (Heterozygote), 100%로 동일하게 (Homozygote) 읽혀야 하기 때문입니다. 이렇듯 위의 두가지 개념을 구분하는 것은, NGS 검사를 통해 해석할 때 매우 중요합니다.

 


[References]

Rizzo, Jason M., and Michael J. Buck. “Key principles and clinical applications of” next-generation” DNA sequencing.” Cancer prevention research (2012): canprevres-0432.