Rare variant association analysis: SKAT, SKAT-O, Burden test

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전장 유전체 연관 분석, GWAS란 무엇인가?

Annovar: Population frequency, in-silico prediction tool 및 기타 database 활용

plink를 이용한 GWAS 분석 및 Manhattan plot 만들기

plink를 이용한 GWAS 분석에 대한 지난 포스팅에 이어서, 이번에는 SKAT을 이용한 rare variant 분석에 대한 포스팅을 정리해보고자 합니다. 유전자에 존재하는 변이(Variant)는 인구 집단 내의 분포 빈도 (Allele frequency)에 따라서, 흔한 변이 (Common variant)희귀 변이 (Rare variant)로 구분됩니다. 전장 유전체 연관 분석 (Genome-wide association study, GWAS)은 이러한 변이 중에서 일반적으로 인구 집단 내에 변이 빈도 분포가 5% 이상인 흔한 변이를 대상으로 하게 되는데, 대부분의 흔한 변이들은 유전학적 선택압 (Selective pressure)이 작은 변이들이기 때문에, 효과 크기 (Effect size)가 작은 것들이 대부분입니다.

 

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따라서 Common variant를 이용한 GWAS 분석으로, 설명이 안되는 유전력을 갖는 질환에 대해서 “Missing heritability“라는 용어가 등장하게 되었습니다. 이후의 후속 연구들에서는, Missing heritability를 설명하기 위해서, 변이의 빈도가 매우 드물지만, 효과 크기가 훨씬 큰 Rare variant 들이 조명을 받게 됩니다.

Missing heritability에 관한 Nature 사설 보기>

Maher, B. Personal genomes: The case of the missing heritability. Nature 456, 18–21 (2008)

Missing heritability

다만 Rare variant의 경우는, 변이 자체의 빈도가 매우 드물기 때문에 통계적으로 변이의 영향을 비교하기 위해서는 매우 큰 수의 표본이 필요한 한계가 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해서, 같은 유전자 내에 존재하는 희귀 변이를 유전자 또는 특정 구역의 단위로 집합 시켜서 분석하는 방법이 제안되었는데, 이것이 Gene-level aggregation test 입니다. 즉, GWAS에서는 개별 SNP의 효과를 변이 단위로 분석이 진행되었다면 (Single variant association test), rare variant의 경우는 여러 개의 variant를 Gene 단위로 그룹화하여, Gene의 효과를 비교 분석 (Multiple variant association test)하는 분석을 진행하게 됩니다.

gene aggregation

이와 같은 분석에서 중요한 점은 ‘어떠한 기준으로 변이를 유전자 단위로 그룹화 할 것인가?’ 하는 문제가 발생하게 되는데, 일반적으로 변이 빈도의 threshold 설정 (MAF 5% vs 1%), 변이의 Functional classification 등을 사용자가 임의로 설정하여 분석을 진행하게 됩니다. 더불어, 각 희귀 변이의 효과들이 동일하지 않기 때문에 개별 변이의 효과를 보정해주는 방법으로 Rare variant allele frequency, In-silico prediction score 등을 이용하게 됩니다. 아래는 이러한 희귀 변이 분석 방법과 각 분석 방법의 장, 단점, 그리고 분석 software를 정리한 표입니다.

rare variant association

위 표의 희귀 변이를 위한 다양한 분석 도구 중에서 오늘은 R package로 개발된 대표적인 분석 도구로 사용되는 Sequence Kernal Association Test (SKAT)에 대해서, 간단히 정리하고 마치도록 하겠습니다. Burden test의 경우는 변이들의 효과 방향이 일정하고, 대부분이 원인 변이이 경우에 더 강력한 통계 검정 방법이고, SKAT의 경우는 각 변이들의 효과 방향이 제각각이거나, 원인 변이의 비율이 적은 경우에 더 강력한 통계 검정 방법입니다.  SKAT-O이 둘의 효과를 통계적으로 최적화하는 optimized rho value를 계산하여, 양쪽의 장단점을 모두 이용하는 방법입니다.

마지막으로 ‘SKAT’ R package를 이용을 위한 code를 공유합니다. 분석에 앞서, 이전 plink 분석 포스팅에서 언급했던 Bed, Bim, Fam 파일 및 phenotype data를 포함하는 PED 파일이 input data로 준비되어야 합니다. 마지막으로 Rare variant 변이들은 어떤 기준으로 그룹화할지에 대한 정보를 지정한 SetID 파일을 생성하여야 합니다. 자세한 내용은 SKAT 패키지의 manual을 참조하시기 바랍니다.


library(SKAT)

setwd("/plink_result")
file_name <- "my_plink"

File.Bed <- paste(file_name,".bed",sep = "")
File.Bim <- paste(file_name,".bim",sep = "")
File.Fam <- paste(file_name,".fam",sep = "")
File.SSD <- paste(file_name,".SSD",sep = "")
File.Info <- paste(file_name,".info",sep = "")
File.SetID <- paste(file_name,".SetID",sep = "")

Generate_SSD_SetID(File.Bed, File.Bim, File.Fam, File.SetID, File.SSD, File.Info)

SSD.INFO <- Open_SSD(File.SSD, File.Info)
FAM <- Read_Plink_FAM(File.Fam, Is.binary=FALSE)
COV <- Read_Plink_FAM_Cov(File.Fam,"pheno_data.ped", Is.binary=FALSE, flag1=0, cov_header=TRUE)

# continuous phenotype
obj <- SKAT_Null_Model(y ~ covariates, out_type="C")
# dichotomous phenotype
obj <- SKAT_Null_Model(y ~ covariates, out_type="D")

# SKAT
out.skat <- SKAT.SSD.All(SSD.INFO, obj)
#SKAT-O
out.skato <- SKAT.SSD.All(SSD.INFO, obj, method="optimal")
#Burden test
out.burden <- SKAT.SSD.All(SSD.INFO, obj, r.corr=1)

data <- cbind(out.skat$results,out.skato$results,out.burden$results)
write.table(data,"SKAT_results.txt",col.names=T,row.names=F,quote=F,sep="\t")

Close_SSD()

 

 


[References]

‘SKAT’ R package

SKAT GitHub: https://github.com/leeshawn/SKAT

Lee, Seunggeung, et al. “Rare-variant association analysis: study designs and statistical tests.” The American Journal of Human Genetics 95.1 (2014): 5-23.

Lee, Seunggeun, et al. “Optimal unified approach for rare-variant association testing with application to small-sample case-control whole-exome sequencing studies.” The American Journal of Human Genetics 91.2 (2012): 224-237.

Bansal, Vikas, et al. “Statistical analysis strategies for association studies involving rare variants.” Nature Reviews Genetics 11.11 (2010): 773-785.

 

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Tandem Repeat Polymorphism과 유전자 발현 조절 메커니즘 (eSTR)

유전학에서 흔하게 이야기하는 용어 중에 Missing Heritability라는 것이 있습니다. 유전적으로 동일한 쌍둥이 연구를 통해, 형질의 차이를 살펴보니 환경적 요인 등 후천적 효과를 제외하면 형질의 최대 7~80 %까지는 유전적으로 설명이 가능하다고 밝혀졌는데, 실제로 SNV와 CNV와 같은 유전적 변이로는 이를 전부 설명하지 못했죠. 특히 최근 광범위하게 연구된 유전학 연구 툴인 GWAS와 NGS를 이용하여서도 이러한 heritability를 전부 설명하지 못했습니다. 연구자들은 이렇게 잃어버린 나머지 유전적 기여의 원인과 메커니즘을 찾기 위해 많은 연구를 진행했고, 오늘 정리할 내용이 Tandem Repeat Polymorphism eSTR (expression Short Tandem Repeat) 입니다.

관련 포스팅 보기 >

[유전학 중요개념 정리] Tandem repeat: STR and VNTR

[유전학 중요개념 정리] eQTL

Tandem Repeat의 개념은 지난 포스팅에서 정리하였는데, Tandem Repeat Polymorphism은 개인별 Tandem Repeat  길이의 차이로 인해 다양한 유전자 발현 정도도 조절이 되어 개인별 차이를 나타낸다는 개념입니다. 유전자 발현을 조절하는 SNP (Single Nucleotide Polymorphism)으로 eQTL에 대해서 정리한 바가 있는데, 최근 연구에 의하면 eSTR도 유전자 발현을 조절하는데 많은 부분 관여하여, Missing Heritability 중 일부를 설명한다고 합니다.

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[eSTR이 유전자 발현에 미치는 효과] STR의 길이에 따라, 유전자 발현량에 차이를 보이는 STR을 통계적으로 검출하여, 실제로 해당 부위가 유전자 발현량에 영향을 미친다는 것을 확인하였습니다.

 

I. STR이 유전자 발현을 조절하는 메커니즘

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STR이 유전자 발현에 영향을 미치는 다양한 메커니즘들이 제안되었는데, 현재까지는 1) Transcription factor binding site를 형성하거나, 2) Reculatory element까지의 물리적 거리에 영향을 미치거나, 3) DNA 2차 구조를 형성하는 방법, 4) splicing 과정에 영향 또는 toxic RNA 형성 등을 통해 유전자 발현에 영향을 미친다고 알려져 있습니다.

 

II. Genome wide profiling method for STR

원래 STR을 검출하는 가장 고전적이고 정확한 방법은 해당 부위를 PCR하여, 전기영동을 통해 size (분자량)를 확인하여 몇번 반복되었는지를 확인하는 것입니다. 그러나 시퀀싱 기술이 발달하면서, NGS 기술을 통해서도 STR을 확인하는 다양한 방법들이 제안되었습니다. 그러나 아직까지 NGS를 이용하여 STR을 확인하는 방법에는 아래와 같은 한계가 존재합니다.

  1. 대부분의 STR은 intron 영역에 존재하기 때문에 WGS (whole genome sequencing) data가 필요하다.
  2. Illumina platform 방식의 짧은 read (100~300bp)를 이용한 방식으로는 길게 반복되는 tandem repeat 검출이 어렵다.

그럼에도 불구하고 다양한 Bioinformatics tool 들이 개발되어, 이러한 한계를 극복하고 있습니다. 아래는 NGS data를 이용하여 Tandem Repeat을 검출하는 다양한 툴들을 보여주고 있습니다.

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[References]

Gymrek, Melissa, et al. “Abundant contribution of short tandem repeats to gene expression variation in humans.” Nature genetics 48.1 (2016): 22.

Gymrek, Melissa. “A genomic view of short tandem repeats.” Current opinion in genetics & development 44 (2017): 9-16.