PCR – 두마디 정밀의료

[실험실 노트] Problems amplifying GC-rich regions? Problem Solved!

PCR 실험 도중 유용한 글이 있어 스크랩한다.

Problems amplifying GC-rich regions? Problem Solved!

No, it isn’t you that’s the problem, and you’re certainly not alone if you’re having trouble amplifying GC-rich sequence and/or understanding why GC-rich sequences are causing such problems in the first place! Amplification of GC-rich sequences by PCR has been an irritant for scientists for decades! When we say “GC-rich” we mean ?60% of the bases are either cytosine (C) or guanine (G.) There are several options available, which alone or in combination may help you to deal with this problem, but first let’s look at why GC-rich sequences are more difficult to amplify.

The Cause of Your Problems

Problem 1. Stability: Thermal and Structural

GC-rich DNA sequences are more stable than sequences with low GC-content. For PCR, this means that the higher the GC content, the higher the melting point of the DNA. Under pressure, such as when exposed to heat, the GC-rich sequences can take far more abuse than GC-low sequences. While the possible role of meditation and yoga having a calming effects on these bases allowing them to take more abuse and still stick together has not yet been investigated, the impact of their structure has been. GC-rich DNA sequences are more stable than sequences with low GC-content, but, contrary to popular belief, the hydrogen bonds are not the primary reason for this stability. Stabilization is mainly due to stacking interactions called base stacking. There is some beautiful biochemistry and biophysics behind this and if you’re interested is a fantastic explanation as to why this stacking occurs.

Fun fact! This is why Thermus thermophilus, an extremophile, has a GC-rich genome, also regions of our genome (assuming of course that you are human) that need to been transcribed very often such as promoter regions of popularly transcribed gene, are AT-rich, like the TATA box- neat huh?!

Problem 2. Formation of Secondary Structures

This point is very much tied to the first point. When GC-rich regions form secondary structures, particularly hairpin loops, they’re very stable and so they stick around and accumulate. These don’t melt well at usual PCR denaturation temperatures. Additionally, primers used to amplify GC-rich regions have a tendency to form self- and cross-dimers as well as stemloop structures that can impede the progress of the DNA polymerase along the template molecule leading to truncated PCR products. GC-rich sequences at the 3’ end of primers can also lead to mispriming.

What a disaster!

Poof! *the sounds of your confidence in your ability to do PCR deflating*

But wait! We have some solutions for you!

Solution 1. Increasing Your Melting Temperature

This is a very sensible solution (in theory.) The higher the temperature, the more likely those troublesome secondary structures formed by GC-rich regions are to separate. However this results in lower product yields as your taq begins to denature more quickly at temperatures in excess of 92.5°C, so it is advisable to only use higher melting temperatures for the first few cycles and to avoid going over 95°C. It might take some playing around but this is solution is a good starting point.

Solution 2. Adjusting Your Magnesium Concentration

Non-specific amplification in general can be exacerbated and even caused by using excessive concentrations of magnesium (Mg) so test the optimum concentration using gradient or titration PCR. In a nutshell, your well on the absolute left contain a less than what you think will work and your well on the absolute right contain an excessive amount of magnesium with a gradient in the middle so you can determine the lowest possible amount you can use to achieve your product.

Solution 3. Calling upon a friend:

I found a few recipes online that various labs have found worked well for them:

Addition of 3-10% dimethyl sulfoxide (DMSO), most often 5%
Addition of 1M betaine and 5% DMSO – these may reduce your enzyme activity so add extra enzyme
Addition of betaine (Sigma), DMSO, DTT and BSA
Addition of ethylene glycol with 1,2-propanediol
Addition of 5 % DMSO and 1.25% formamide or just formamide
Addition of 5 – 10% absolute glycerol and higher temperature of annealing
Use regular HotStart and add 2M betaine
Use Kapa’s HiFi Hot Start enzyme
Use KAPA3G GC rich Kit with 5% DMSO
GC enhancers available in various kits like this Clontech, Epicentre and Qiagen also both offer kits for this problem if you’ve some money to spare.

Some of these options are beautifully summarized with links to references here. We also have a post detailing different PCR additives and how they can help you.

Solution 4. Other types of PCR

Nested-PCR: I’ve written entirely on this technique so stay tuned for that!
Slowdown-PCR: explored here.
Hot-Start PCR.
Long range PCR: clontech and qiagen both offer kits for this problem if you’ve some money to spare.

These forms of PCR and more are described simply and briefly here.

So you’ve looooads of options! Let us know what has worked for you in the comments below.

[References]

https://bitesizebio.com/24002/problems-amplifying-gc-rich-regions-problem-solved/

Base stacking: Kool ET. (2001) Hydrogen bonding, base stacking, and steric effects in DNA replication. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 30:1–22.

Betaine and DMSO: Bhagya CH, et al. (2013) Polymerase Chain Reaction Optimization for Amplification of Guanine-Cytosine Rich Templates Using Buccal Cell DNA. Indian Journal of Human Genetics 19.1:78.

Ethylene glycol with 1,2-propanediol: Zhizhou, Z. et al. (2009)Enhanced Amplification of GC-rich DNA with Two Organic Reagents. BioTechniques 47.3 : 775-79. Web

Using formamide in PCR: Sarkar, G., et al. (1990). Formamide can dramatically improve the specificity of PCR. Nucleic Acids Research, 7465-7465.

[스크랩] PCR에서 GC enhancer의 역할

PCR 관련 제품 제조회사에서 GC enhancer, band helper 등등으로 판매하는 제품이 어떠한 원리로 작동하는지 검색하다가 유용한 답변이 있어, 스크랩한다.

해당 solution에는 betaine과 비슷한 물질이 포함되어 있는데, 이 물질은 AT의 이중 수소 결합과 GC의 삼중 수소 결합에 영향을 미치고, 결론적으로 GC 결합의 안정도를 AT 결합보다 더 떨어뜨려 AT와 GC의 안정도의 차이를 줄여주는 효과를 일으킴으로써 GC content의 차이에 의해서 PCR이 영향을 받는 걸 줄여준다.

Betaine has a sequence independent destabilizing effect on all DNA base pairing interactions due to its charged nature. This reduces the stability of hydrogen bonds and lowers the Tm of AT and GC rich regions by roughly the same amount. With this effect alone, GC rich regions would still have higher Tm’s relative to AT rich regions.
Betaine also binds preferentially to the major groove of AT sites due to a slight hydrophobic effect between betaine and thymine’s major groove methyl group. This has a sequence dependent stabilizing effect that increases the stability of the double strand DNA in AT regions relative to GC regions.

[Reference]

Why do some PCR kits include GC Enhancer solution? What does this chemical do?

Gibson Assembly 활용

전통적인 Restriction enzyme을 활용한 Cloning의 경우, overhang되는 nucleotide가 많아야 4~6개 정도 밖에 안되기 때문에 특이도도 떨어지고, 효율성의 측면에서 안타까운 점이 많다. Gibson assembly는 Restriction enzyme site에 구애받지 않으며, T5 exonuclease의 특성을 활용하여 더 특이적이고 효율적으로 Cloning을 수행할 수 있다. 마지막으로 동시에 여러개의 assembly를 동시에 한번에 반응시킬 수 있어 시간이 엄청나게 단축되며 편리하다.

Primer design

Gibson assembly는 서로 fusion 하고자 하는 fragment 부위에 15~20 bp 정도의 homology 서열이 중복되도록 디자인한다. 2개 이상의 fragment를 fusion하고자 하는 경우, 겹치는 부분이 20bp 이상이 되도록 한다. Primer의 3′ portion의 5bp는 2개 이상의 G or C가 포함되지 않도록 한다. Primer의 전체 Tm 값이 50도 보다 높아야한다. 50도보다 높지 않을 경우, homology sequence의 길이를 더 늘려서 50도를 넘기도록 한다.

nmeth.1318-F1 — [Gibson assembly scheme] Overlap 부위에 15~20bp 정도의 서열을 디자인하고, T5 exonuclease가 5′ 부위부터 nucleotide를 파먹어 가면 서로 complementary한 서열이 노출되면서 2개의 fragment가 annealing 된다. 마지막으로 ligase가 전체 서열을 다시 복원해주면서 완전한 fusion이 완성된다.

T5 exonuclease

Gibson assembly는 T5 exonuclease의 특성을 활용한 기법이다. 해당 효소는 5′ 방향부터 차례로 nucleotide를 떨어뜨려주는 특성을 가지고 있다.

Gibson Assembly 활용

Gibson assembly는 여러 개의 fragment를 동시에 그것도 restriction enzyme site에 구애받지 않고 반응 시킬 수 있어 유용한 분자생물학적 tool이다. 특히 Cloning 과정 중에 Insert와 Backbone 등을 restriction enzyme으로 digestion하고 gel-purification 해야했던 귀찮은 과정 없이, 모든 product를 High-fidelity PCR Rxn을 이용하여 준비하여 바로 반응시키면 된다. 여러 fragment를 assembly로 준비하여 socket 처럼 서로를 결합시킬 수 있다.

Gibson assembly 방법을 소개한 NEB site 동영상

https://www.neb.com/tools-and-resources/video-library?device=modal&videoid=23f3833f-08ca-4fd8-aaa1-f9e7fb2bb9e3

https://www.neb.com/tools-and-resources/video-library?device=modal&videoid=ed19cc98-4318-4d85-896e-4a90e25cd5a9

[참고문헌]

Gibson, Daniel G., et al. “Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.” Nature methods 6.5 (2009): 343.

[스크랩] Tips for successful cloning from NEB

NEB 사이트에서 클로닝 실험에 도움이 되는 유용한 동영상이 있어서 스크랩합니다.

[실험실 노트] 성공적인 Cloning 실험을 위한 Tip

최근에 뒤늦게 파이펫을 잡기 시작해서, 요새 wet lab의 세계에 풍덩 빠져 있습니다. 두달 가까이 클로닝 실험만 했는데, 흔히 말하는 사수가 없어서 고생이란 고생은 죽실나게 하면서 실패하기를 여러 차례, 드디어 클로닝 실험에 성공하였습니다! 구글신과 BRIC 실험 Q&A 등등 실험 노하우에 대해서 살펴 보면서 나름대로 연구를 했는데, 이번 포스팅은 이러한 저만의 개(?)고생을 토대로 터득한 클로닝 실험의 노하우들을 포스팅해보고자 합니다.

pcr-based-cloning.gif__800x346_q85_crop_subsampling-2_upscale — [Plasmid Cloning의 모식도] Cloning은 E.coli, Yeast 또는 mammalian cell과 같은 유전자 발현 시스템에 원하는 유전자를 삽입한 vector를 제작하여 이루어 지는데, 대부분 plasmid를 vector로 사용하여, 원하는 유전자를 효소가위로 절단하여 삽임함으로써 이루어집니다. addgene protocol [https://www.addgene.org/protocols/pcr-cloning/]

어떤 제한 효소(Restriction enzyme)를 선택하는지가 매우 중요하다.: 플라스미드를 제한효소로 자르고, 그 잘라진 부위 안쪽으로 PCR로 증폭시킨 유전자를 삽입하게 되는데, 대부분 벡터 잘리는 단계는 다 잘됩니다. 대부분 안되는 단계는 다시 ligation 하여 최종 원하는 target product 콜로니가 안나와서 문제! 이때 선택하는 제한효소는 Insert Gene을 자르지 않으면서, 벡터의 유일하게 한군데만 자르는 것으로 선택하게 되는데 그러다 보니 효소 자체의 efficiency가 좀 떨어지는 것을 고를 수도 있는 것 같습니다. 제한 효소가 얼마나 벡터와 특히, Insert (PCR product)를 잘 잘라서 sticky end를 확실히 만들어 주느냐가 가장 중요한 문제인데, 이론적으로는 잘 잘린다고 나와있다 하더라도 실험조건에 따라서 차이가 많은 것 같습니다. 저는 NdeI과 NcoI으로 실험하다가 너무 안 되어서, NcoI 효소의 효율이 그리 좋지 않은 것 같아, 다른 위치의 정말 잘 잘린다고 알려진 EcoRI으로 바꿨더니 성공적으로 되었습니다!
PCR의 프라이머 디자인과 PCR 조건도 매우 중요하다.: Insert에 제한효소가 자를 자리가 없는 경우에 프라이머 끝쪽에 인위적으로 자를 수 있는 서열을 넣어주는 경우가 있는데, 이때는 효소가 3차원적인 구조를 인식할 수 있도록, 5~6bp를 추가로 5′ 쪽에 넣어줘야합니다. 이 PCR 산물이 적절이 증폭되고, 또 제한 효소에 의해 잘려서 ligation이 일어날 수 있는 sticky end가 만들어져야 하는데, 많은 제한 효소들이 벡터보다 잘 자르지를 못하는 경우가 많습니다. 다음 주소의 NEB 사이트에서 제공하는 표에는 각 제한 효소 별 활성도가 나오는데, 제 개인적인 의견은 3bp만 붙여도 반응이 좋다라고 나와 있어도, 안정적으로 6bp 이상 넉넉하게 tag sequence를 붙이는 게 더 좋은 것 같습니다. (실제로 2~3개만 붙였더니 잘 안됨.) 더불어 Primer 내에서 palindromic sequence가 없는지, hair pin 구조나 dimer를 형성하는 것은 없는지 꼭 체크! ( ligation이 정말 안되길래 나중에 다시 확인해 보니, palindromic structure를 형성하면 제한 효소가 구조를 인식하지 못해서 안잘리는 것이더군요.) 주변 동료로 부터 하나 더 추가로 배운 Tip은 PCR 조건에서 Final extension 시간을 충분히 잡는 것도 도움이 될 수 있다고 합니다. 이유는 불완전한 PCR에 의해 제한 효소 서열이 위치한 끝부분의 복제가 제대로 안되어 인식을 못할 수 있기 때문이라네요.
제한 효소 반응은 충분하게 많은 양을 반응시키고, Gel 전기 영동도 정성 들여서 내리자. 전기영동으로 원하는 vector와 insert를 분리해내면, 이 둘만 순수하게 추출해서 ligation step을 거치게 되는데 gel을 거치는 순간 산물의 수득률(순도 및 농도)은 엄청나게 떨어지게 됩니다. 따라서 충분한 양 (protocol에서는 DNA 2~5ug을 권장)을 충분히 반응시켜서 (overnight 또는 100%에 가깝게 다 잘렸다고 확신이 될 정도로 / 물론 효소나 star activity에 따라 달라집니다.) 고농도로 gel에 전기영동 거는 것이 중요합니다. 또한 한약을 정성들여 다리는 마음으로 천천히 오랜시간 동안 분리되도록 하여, 크기에 따라 세밀하게 분리가 되도록 합니다. (50V, 2~3시간) Gel을 내렸을 때, 잘린 벡터와 Insert가 진하고 통통하게 나오지 않았다면, 실험이 안될 확률이 매우 높습니다. DNA contamination이 되지 않도록 각별히 신경써서, self-ligation 된 콜로니가 뜨지 않도록 주의 합시다!
Ligation 단계에서 주의할 점: 보통은 벡터와 Insert를 1:3의 비율로 섞어서 ligation 하라고 되어 있습니다. 그러나, 하나라도 제대로 들어가기만 하면 원하는 콜로니를 얻을 수 있기 때문에 실험이 잘 안될 경우 Insert를 과량으로 넣어서 진행해봅니다. 되도록 vector의 DNA의 양은 최소로 하고, Insert는 경우에 따라 1:8, 1:10 등의 비율로 넣어도 어차피 될 거면 된다고 합니다. 그리고 transformation을 할 competent cell의 효율로 무척 중요합니다. 콜로니가 잘 안 뜰 때는 competent cell의 efficiency 및 heat shock 유무도 잘 챙깁니다. (저희가 쓰는 DH5a cell은 transformation 시에 heat shock을 안 줘도 되도록 만들어져있지만, 20분 ice incubation 후 42도에서 1분간 heat chock, 그리고 다시 20분 ice incubation 하면 더 효율이 좋다고 합니다,)
Regeneration 과정을 빼먹지 말자.: Antiobiotic marker로 selection 하기 전에, marker가 없는 배양 배지에서 1시간 정도 selection marker를 충분히 발현 할 수 있도록 몸집을 불릴 시간을 주고, centrifuge를 돌려 상층액은 버리고 plating 합니다.
기타 추가 미세 팁

Mini prep, PCR purification, Gel extraction 등의 단계에서 마지막에 elution 할 때는, elution buffer 대신에 DW를 쓰자. : elution buffer의 조성이 효소 반응에 영향을 줄 수도 있으므로 되도록 37도로 따뜻하게 데워놓은 DW를 사용하는 게 좋습니다.
제한 효소 제조 회사의 fast-digest, high-fidelity 등의 말은 너무 맹신하지 말자. : T모 사의 Fast-digest 제한 효소의 경우, 광고에는 5~15분이면 반응이 다 끝난다고 되어 있는데 실제로 써보니 클로닝은 충분한 시간 반응 시키는 것이 더 중요한 것 같습니다.
실험은 꼭 다양한 조건으로 parallel 하게 진행하고, 동시에 positive 및 negative control을 걸어서 어디가 문제인지를 꼭 확인할 수 있도록 하는 것이 시간을 아끼는 지름길이다!
정말 실험을 완벽히 했는데도 안된다면, 무언가 디자인이 잘못되었을 가능성이 높다. 하나씩 천천히 프라이머 디자인 및 PCR 과정을 찬찬히 살펴보자. 저는 돌이켜 보니, 프라이머 디자인 잘못해서 3번이나 다시 주문했습니다..
그래도 안되는 건 안되는 것이다. Gibson assembly, TOPO cloning 등 다른 방법으로 시도해보자. (6개월만 클로닝하다가 결국 실패한 선배 왈, 정말 안되면 포기하고 다른 방법을 찾아보는 것도 좋다. ex. TA벡터에 sub-cloning)

pcr-based-cloning-2a.gif__700x121_q85_crop_subsampling-2_upscale — 프라이머와 제한효소 인식 부위 서열을 직접 손으로 써가면서 비교해보면, 잘못된 것이 발견되기도 합니다. 한번 양 끝 서열을 써보면서 비교해보는 것도 프라이머 오류를 확인하는 좋은 방법입니다.

이론상으로는 참 쉬운데, 현실을 마음처럼 안되는 2달에 가까운 클로닝 여정기 였습니다. 사실 별것 아닌데, 마음대로 쉽게 안되어서 너무 힘겨웠는데 덕분에 그 과정에서 많은 것을 배운 것 같습니다. 혹여나 저 처럼 클로닝으로 고통받는 분들에게 도움이 되기를 바랍니다.

[Updated]

현재는 제한 효소를 이용한 고전적인 방법 이외에 훨씬 간편하고 쉬운 클로닝 방법들이 많이 개발되어 있습니다. 위의 내용들은 참고만 하고, 다른 방법으로 먼저 시도하는 것이 좋습니다.