최근 시퀀싱 검사의 대세는 NGS 이지만, 여전히 논문을 위한 논문에서는 Gold standard인 Sanger 시퀀싱 결과를 Supple data로 요구하고 있다. 이번에 유전자 30개 정도되는 NGS 패널을 디자인하고, 검출된 변이로 Sanger 시퀀싱 확인 및 가족 검사 까지 진행하고 있는데, M모 업체를 통해 견적을 받아보니 타겟 위치 셋업 비용 10만원 + 검체 추가당 3만원 + Blood에서 DNA 추출 검체당 3만원을 달란다. 의뢰할 검체가 50여개는 되어서 정말 정말 귀찮지만, 연구비는 소중하니까.. 에라잇.. 주말을 전부 바쳐 직접 노가다로 진행하고 5백만원을 아끼자 마음 먹었다ㅠㅠ 그래서 오늘의 실험실 노트는 생어 시퀀싱을 위한 Primer 디자인 과정을 남겨 본다.
I. 검체 Blood에서 DNA 추출하기
남들이 많이 사용하는 Q사의 Blood DNA Extraction Kit를 사용한다. Manual에서 하라는 대로 따라하니까, 크게 무리 없이 DNA가 잘 뽑혀져 나온다. 다만, 검체가 오래되었거나 WBC count가 적은 경우, 또는 Blood volume이 procedure에서 요구하는 200uL보다 적은 경우에는 마지막에 elution volume을 좀 작게 해야될 것 같다. (방법은 정말 쉽지만, 검체가 50개의 스케일로 넘어가는 순간 정말 노가다.. 파이펫 팁만 몇개를 쓴 건지… 대부분의 과정이 기계에 의해 자동화되어 있던 진단검사의학과 검사실의 풍경이 눈 앞을 아른거린다ㅠㅠ)
II. 타겟 영역 선정 및 Primer 디자인하기
0. 논문들의 supplement data를 잘 살펴보자. 다른 논문에서 이미 디자인된 primer 정보가 있다면 적극 활용하자. (재현만 잘 되면 새로 짤 필요 없다.)
a. NGS 검사에서 나온 변이들의 exon을 골라, 유전자와 exon number, 그리고 올바른 transcription mode에 해당하는 NM number를 정리한다.
b. Ensemble Genome Browser를 이용해, NM number를 통해 해당 위치에 접근하여, exon 영역과 앞 뒤 200bp 정도를 포함하는 시퀀스를 display한다. (GRCh37, hg19 등 Genome Version이 맞는 사이트로 접근)
c. Sanger 시퀀싱을 할 경우, 읽는 primer 뒤로 50~100 bp는 퀄리티가 나빠 제대로 안읽히기 때문에 primer는 최소한 타겟 영역의 100bp 이상 앞쪽에서 잡는다. Forward와 Reverse간의 간격은 500bp 전후로 적당히 잡는다. 어차피 8~900 bp 넘어가면 그 뒤는 퀄리티가 나빠져서 못 읽는다.
d. GC contents 40~60%이고, primer 길이 20~25bp 정도 되는 시퀀스를 골라서 Forward와 Reverse 서열을 선택한다. 이때 선택한 서열을 primer 평가 프로그램을 통해, dimer 또는 hairpin 이 형성되지는 않는지 살피고, 서로의 Tm 값이 5도 이상 차이나지 않도록 한다. Reverse primer의 경우, pick-up한 시퀀스의 Reverse Complement 서열로 주문해야한다.
Primer 평가: http://www.premierbiosoft.com/NetPrimer/AnalyzePrimer.jsp
Tm 값 계산: https://tmcalculator.neb.com/
시퀀스 뒤집기: http://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html
e. UCSC Genome Browser에서 제공하는 In-silico PCR을 통해, pick-up한 primer가 원하는 영역에 잘 PCR 되는지 시뮬레이션 해본다. (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr)
f. 디자인한 primer를 업체에 주문한다.
g. I에서 뽑은 DNA와 주문한 primer로 PCR 반응 시킨다. 이때, Ta 값은 Tm 값보다 2~3도 낮은 온도에서 시작해서, 잡밴드가 많이 뜨면 온도를 더 높혀본다. 최적의 PCR 조건을 찾아서 원하는 타겟 영역을 증폭시킨다. (Gradient PCR를 해서 최적 온도를 찾는 것도 좋은 방법)
h. 원하는 크기의 타겟 영역의 밴드가 뜨면, product를 purification 해서 업체에 생어 시퀀싱을 의뢰한다.
타겟 영역별 프라이머 주문비용: 만원 / 시퀀싱 비용 검체당 대략 5천원 내외 / 전체 예상 소요 비용 50만원도 안됨.
1/10 도 안되는 가격으로 원하는 결과를 얻었다. (뿌듯..)
단점: 엄청난 노가다 및 손이 많이 감. Primer design 및 최적 PCR 조건을 찾는데 어려움이 있을 수 있다. 안되면 Primer를 다시 짜서 재주문해야됨. 되도록 Primer는 22~25bp 정도로 길게 잡자.(그래야 잡밴드가 적게 뜬다.)
두마디 정밀의료 