[NGS DNA-SEQ] Functional Equivalence pipeline: CROMWELL, WDL

gnomAD, TOPMed 등 대규모 유전체 코호트들이 만들어지면서, 여기서 생산된 데이터를 이용하는데 중요한 문제가 부각되었는데, 바로 분석 결과 간의 재현성호환성에 있었습니다. 즉, 연구자가 GATK Best practice를 이용하여 Exome 또는 Genome 시퀀싱 분석을 진행하더라도 어떤 설정과 파라미터 값을 넣느냐에 따라, 최종 검출 변이의 결과가 달라지고, 이것은 연구 결과 간의 재현성의 측면에서 매우 중요한 문제가 되었던 것이지요. 참고논문에서 진행한 실험 결과를 보면, 동일한 샘플로 생산된 FASTQ 파일을 서로 다른 5개의 기관에 보내 각각의 파이프 라인으로 분석한 결과, Call된 변이들 간에 많은 차이가 있었다고 보고하고 있습니다.

[관련 포스팅 보기]

따라서, 점점 늘어나는 유전체 데이터만큼 유전체 분석 파이프 라인을 하나의 표준화된 파이프 라인으로 통합하는 것이 매우 중요해졌고, 그 결과 개발된 것이 “Functional Equivalence (FE)” Pipeline (기능적으로 동등한 파이프라인) 입니다. 사실 NGS 분석을 하는 사용자의 입장에서는 Input만 넣고, Output만 나오면 편한데, 그동안 개발된 툴들은 이를 모두 아우르는 것이 아니라, 그때 그때마다 필요한 부분들을 개발했기 때문에, 분석 파이프 라인도 이제야 어느 정도 성숙 단계에 이르렀다고 할 수 있습니다. 따라서 최근의 대규모 유전체 컨소시엄들은 모두 “Functional Equivalence ” Pipeline 을 통해 생산된 유전체 데이터를 생산하는 것으로 채택하고 있습니다. (그래서 저도 functional equivalent한 결과를 얻기 위해서 최근에 새롭게 공부를 하게 되었습니다.)

[ Functional Equivalence Pipeline Overview]

FE 파이프라인을 제공하기 위해서, Broad Institute의 개발진들은 WDL (Workflow Description Langauge)과 Cromwell이라고 하는 프로그래밍 언어를 개발하는데, 하나의 파이프라인을 패키지로 묶은 WDL 파일을 만들고, 이를 Cromwell이라는 프로그램으로 구동시켜주는 원리라고 합니다. 사실 사용자의 입장에서는 과거에 개별 프로그램을 설치하고, 개별 스텝을 따로 돌려야했다면, 지금은 이러한 것들이 모두 하나의 패키지 형태로 제공되기에 더욱 편해졌다고 할 수 있습니다 (?).

[Cromwell 페이지 바로 가기] https://cromwell.readthedocs.io/en/stable/

[WARP 페이지 바로가기] https://broadinstitute.github.io/warp/docs/get-started/

Cromwell의 로고: 꼬마돼지 베이브와 스타트렉에 출연한 배우 James Cromwell을 오마주한 로고라고 합니다 🙂

병원 검사실을 운영하는데, 검사 장비와 보고 방법을 표준화하는 것은 매우 중요한데, 유전체 분석 파이프 라인에도 이제야 이러한 개념이 들어왔다는 점이 반갑습니다. (분석 파이프 라인 하나도 이렇게 표준화하기가 어렵습니다.) Genome의 경우에는 처리해야할 데이터의 크기가 워낙 방대하기때문에 더욱 어려운 점이 있는 것 같습니다. 현재 이쪽 분야도 많은 Computational Scienctist들이 뛰어들어서 개발을 진행하고 있는 중이기 때문에, 추후에 더 User-friendly하고 간편한 파이프 라인이 개발되어 제공되기를 기대해 봅니다. (점차 대세는 클라우드로 옮겨가지 않을까 합니다?)

[References]

Regier, Allison A., et al. “Functional equivalence of genome sequencing analysis pipelines enables harmonized variant calling across human genetics projects.” Nature communications 9.1 (2018): 1-8.

NGS Target enrichment method: Hybridization vs. Amplicon capture

우리가 흔히 차세대 염기 서열 시퀀싱이라고 부르는 NGS 기술에서 가장 현실적으로 중요한 요소는 아직까지는 ‘비용 (cost)’일 것입니다. 시퀀싱 비용이 점점 떨어지고 있기는 하지만, 여전히 가격대비 효율성을 고려할 때 임상적인 목적으로는 질병 특이적인 타겟 패널 시퀀싱 (Targeted panel Sequencing)을, 그리고 연구용으로 이용할 때는 엑솜 시퀀싱 (Whole Exome Sequencing)을 주로 이용하고 있습니다.  타겟 패널 시퀀싱과 엑솜 시퀀싱은 시퀀싱 과정에서 게놈 시퀀싱과는 다른 점이 있는데, 바로 Target enrichment 과정의 유무입니다. 그래서 이번 포스팅은 시퀀싱 과정 중 Target enrichment 방법과 원리, 그리고 각 방법별 장단점을 정리해보고자 합니다.

관련 포스팅 보기>

NGS 검사: Whole Genome & Exome, Targeted Sequencing 비교

 

게놈 시퀀싱과 달리 엑솜 시퀀싱을 포함하는 타겟 시퀀싱은 전체 유전체의 매우 적은 부분을 시퀀싱하는 방법입니다. (참고로 엑솜 영역은 전체 유전체의 2~3% 미만입니다.) 따라서, 원하는 해당 부위만 특이적으로 capture를 해야합니다. 즉, 엉뚱한 부위에 가서 프로브가 붙어서 시퀀싱 데이터를 생산하면 안된다는 소리입니다. 이를 위해서는 타겟으로 하는 영역을 적절하게 검출하고 분리하는 방법이 필요한데, 민감도와 특이도를 모두 높히기 위해 일반적으로 Target enrichment (타겟 영역만 선택적으로 분리하여 증폭시키는 방법) 과정이 포함되어 있습니다.

Target enrichment는 크게 아래와 같은 3가지 방법들이 사용되고 있습니다.

1) Hybrid capture 방법, 2) Selective Circularization 방법, 3) PCR 기반 Amplicon 방법

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Hybrid capture는 타겟 영역에 특이적인 capture probe로 구성되어 원하는 부분만 caputre하는 방법이고, Circularization 방법은 probe가 circle 형태로 달라 붙어 원하는 부위를 증폭한 후에 연결하는 방법입니다. 마지막으로 Amplicon 방법은 원하는 타겟 영역을 PCR로 증폭시켜서 분석하는 방법에 기반합니다. 이 때 catpure 방법의 가장 중요한 요소는 크게 아래와 같습니다.

 

  • Sensitivity: 얼마나 민감하게 원하는 타겟 영역들을 잘 검출할 수 있는가?
  • Specificity: 타겟 영역 특이적으로 검출이 되는가? = 타겟 영역 이외의 영역 (Off-target)을 증폭하거나 검출하지는 않는가?
  • Coverage uniformity: 다수의 타겟 영역을 증폭할 때, 모든 타겟 영역들이 bias 없이 고르게 증폭되는가? > 특정 영역만 depth가 낮게 증폭된다면 해당 영역을 검출하는데 문제가 됩니다.

 

가장 대표적인 Hybrid capture와 Amplicon 방법의 장단점을 정리하면 아래와 같습니다. 다만, 요즘 추세는 대부분 Hybrid capture 방법으로 가고 있는 것 같습니다. Hybrid capture 방법의 단점으로는 상대적으로 DNA 검체량이 조금 더 많이 필요하고, 좀 더 작업 과정이 복잡하여 까다롭다는 점을 들 수 있겠습니다. 따라서 최근 개발되는 엑솜 시퀀싱 capture 패널은 대부분 이러한 단점들을 개선하여 요구되는 검체 최소량을 줄이고, 전체 엑손 영역을 고르게 검출할 수 있다는 점을 부각시킨 제품들로 출시가 되고 있습니다.

 

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[Reference]

Mertes, Florian, et al. “Targeted enrichment of genomic DNA regions for next-generation sequencing.” Briefings in functional genomics 10.6 (2011): 374-386.

 

마지막으로 비록 조금 오래된 영상이기는 하지만, 슬라이드 정리가 잘 된 유투브 영상이 있어 첨부합니다.

 

NGS 검사: Whole Genome & Exome, Targeted Sequencing 비교

임상 검사 및 연구 목적의 검사로 시행하는 염기서열 분석 방법은 기존의 생거 시퀀싱에서 차세대 염기서열 분석법 (Next-generation sequencing; 이하 NGS)로 빠르게 바뀌어서, 이제는 대부분 NGS로 생산된 엄청난 유전체 데이터가 쏟아지고 있습니다. 하지만 이러한 데이터의 생산보다 더 중요한 것은 어떠한 목적과 목표를 가지고 생산된 데이터를 활용할 것인가에 있다고 하겠습니다. 그래서 이번 포스팅에서는 NGS 기술을 이용하여 DNA 시퀀싱을 하는 대표적인 3가지 검사법에 대해서 비교 및 정리하고자 합니다.

관련 포스팅 보기>

NGS 타깃 시퀀싱 패널 검사의 분석 및 해석시 고려할 사항

NGS Targeted Gene Panel 디자인을 위한 고려 사항

Exome sequencing을 위해 고려할 요소들: capture kit와 target coverage 선택

SNP array와 array CGH의 원리 및 UK Biobank Array, Korean Chip

 

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I. Whole Genome Sequencing (WGS)

유전체 전체의 시퀀스를 모두 검사하는 방법입니다. 유전체 전부를 보기 때문에, 개별 시퀀스의 깊이 (depth)는 낮아지지만, 이론적으로 유전체 모든 영역의 SNP (Single Nucleotide Polymorphism), INDEL (Insertion & Deletion), SV (Splicing variant), CNV (Copy number variant) 등을 확인할 수 있습니다 (물론 short-read에서는 repetitive 영역을 모두 보는 것은 불가능합니다). 단, 검사 단가가 비싸고 생산된 유전체의 크기가 매우 커서 분석 및 저장에도 많은 비용이 들어갑니다. 그러나 non-coding 영역의 regulatory variant를 발굴하고, 전체 유전체 영역을 동일하게 가정하는 Genome-wide Null 분석이 가능한 장점이 있습니다.

 

II. Whole Exome Sequencing (WES)

유전체 중에서 단백질을 직접 코딩하는 엑손 영역 (Exome; 엑솜)의 유전체만을 분석하는 방법입니다. 사람의 경우, Exome은 전체 유전체의 2% 미만이기 때문에 WGS보다 생산되는 데이터의 크기가 작아, 저장 및 연산 용량도 줄어들고 가격도 저렴합니다. WGS을 분석하더라도 많은 경우, non-coding 영역의 변이는 해석이 어렵고 크게 의미 있는 결과를 얻는 경우가 많지 않기 때문에 WES이 더 경제적이고 더 높은 depth를 얻을 수 있는 장점이 있습니다. 하지만, 타겟 영역을 제외한 부위 (Intergenic 또는 Intron 영역의 regulatory variant)는 검출이 어렵습니다.

 

III. Targeted Gene Sequencing (TGS)

특정 질병 또는 목적에 부합하는 유전자들로만 구성된 Customized 패널을 구성하여 검사하는 방법입니다. 상대적으로 좁은 영역의 유전체만을 대상으로 하기 때문에, 적은 용량의 데이터를 생산해도 높은 시퀀싱 Depth를 얻을 수 있고, 가격적으로도 가장 저렴합니다. 효율적으로 원하는 유전자들로 입맛에 맞게 유전자 패널을 구성하여, 데이터의 연산 및 저장 용량도 줄일 수 있습니다. 대표적으로 약물 대사에 관련된 유전자로 구성된 약물 유전체 패널, 암 발생과 관련된 유전자들로 구성된 고형암 패널 등이 있습니다. 타겟으로 하는 유전자가 명확하고 보고자 하는 영역이 명확한 경우에 가장 적절하여, 임상 검사실에서 가장 많이 사용하는 검사 방법입니다.

NGS modalities
[유전체 검사의 범위에 따른 가격, 용도 및 도구] 더 폭넓은 유전체를 검사할수록 가격은 일반적으로 더 비싸지고, Depth는 낮아지게 됩니다. 검사 목적에 따라 적절한 modality를 활용하는 것이 중요합니다.
 

위의 3가지 검사법을 결정해야할 때 고려해야할 요소는 크게 다음과 같습니다.

  1. 검사 목적: 진단용인가? 연구용인가? 연구용이라면, 연구 대상의 유전자가 제한된 연구인가 또는 새롭게 발굴하는 것이 목적인가?
  2. 분석 대상: 특정 유전자에 한정할 것인가? 해석이 용이한 엑손 영역에서 새로운 유전자를 발굴할 것인가? 전체 유전체에서 탐색적으로 연구할 것인가?
  3. 검체 이용 및 시퀀싱 깊이: 어떠한 검체를 이용할 것이며, 시퀀싱 깊이는 어느 정도가 적절한가?
  4. 검사 비용 및 분석 능력: 시퀀싱 결과 생산된 데이터의 크기가 매우 크기 때문에 이것을 분석하는 컴퓨팅 파워 및 용량, 전체적인 비용도 고려해야 합니다.

올해부터 한시적으로 임상 검사의 목적으로는 타겟 시퀀싱 패널 (TGS)에 대해서 보험 급여가 인정되어 임상 검사실에서 시행되고 있고, WES 및 WGS의 경우에는 진단의 목적보다는 연구 목적으로 새로운 후보 유전자 또는 영역을 발굴하는 목적으로 많이 사용하고 있습니다. 위의 3가지 외에도 최근에는 Clinical Exome Sequencing이라고 하여, 전체 엑손 영역 중에서 임상적으로 질병과 연관된 유전자들로만 구성된 일종의 광범위 타겟 시퀀싱 패널과 같은 검사도 WES보다 좀 더 저렴하게 검사가 가능합니다.

또한, 연구자의 입장에서 비용 만을 생각하면 시퀀싱보다는 micro-array 기반의 검사가 더 저렴하고 간편한 경우도 있기 때문에 (e.g. 한국인칩 ㅠㅠ), 목적에 적합한 검사를 선택하는 것이 중요하다고 할 수 있겠습니다. Array 검사법과 시퀀싱 검사법의 비교는 나중 포스팅에서 다루도록 하겠습니다.

 

[References]

https://blog.genohub.com/2015/02/21/whole-genome-sequencing-wgs-vs-whole-exome-sequencing-wes/

https://blog.genohub.com/2016/10/24/targeted-gene-panels-vs-whole-exome-sequencing/