[실험실 노트] 유전자 가위 CRISPR/Cas9을 이용한 Gene Editing

최근에는 유전자 가위 기술이 워낙 보편화되어서, 일반 연구자들도 실험을 할 때 특정 유전자를 Knock-Out 시키기위해서 CRISPR/Cas9을 많이 이용하는 것 같습니다. 저도 최근에 특정 유전자의 기능을 연구하면서, 해당 유전자를 Knock-Out 시키기 위해서CRISPR/Cas9을 이용하려고 하다보니, 해당 메커니즘이나 원리를 제대로 한번 정리해볼 필요가 있다는 생각이 들었습니다. 그래서 이번 포스팅은 흔히 유전자 가위라고 불리는 CRISPR/Cas9 의 작동 원리와 해당 원리를 이용한 타겟 유전자 편집에 대해서 정리해 보고자 합니다.

CRISPR/Cas9의 발견 및 기본 원리

CRISPR : Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

Cas: CRISPR-Associated protein

gRNA: guide RNA, crRNA: CRISPR RNA

PAM sequence: Protospacer-Adjacent Motif

CRISPR/Cas9는 원래 처음 대장균 (E.coli)에서 발견되었는데, 세균이 외부의 바이러스의 침투로 부터 스스로를 지키기 위한 면역 체계의 일종입니다. 세균이 스스로 CRISPR 단백을 만들어서, 외부의 바이러스의 유전체는 잘라버리는 특성을 우연히 발견한 후에 해당 원리를 이용한 것이 최근의 유전자 가위 기술의 토대입니다. CRISPR의 가장 큰 장점은 guideRNA가 CRISPR 단백을 자를 위치로 이동 시켜주기 때문에, 자르고 싶은 곳의 서열에 맞춰서 gRNA를 잘 디자인하면 원하는 부위에 타겟팅이 용이하다는 점입니다. CRISPR의 특징이자 제한점은 흔히 PAM sequence (일반적으로 -NGG-)라고 부르는 특이 서열을 인식하여 유전자 가위가 작동하기 때문에, 타겟 영역에 PAM sequence가 존재해야한다는 점입니다.

CRISPR/Cas9을 이용한 유전자 편집

위의 그림은 CRISPR/Cas9을 이용한 유전자 편집 과정에 대해서 잘 설명해주고 있습니다. 실험 설계를 위해서는 크게 1) guide RNA 디자인, 2) Vector 등을 이용하여 디자인한 gRNA와 Cas9 단백을 발현하는 형질을 세포 등의 시스템에 도입, 3) 정상적으로 발현이 될 경우, 타겟 DNA 절단 의 과정을 거칩니다. 마지막으로, 타겟 세포에서는 정상적인 수리 과정인 NHEJ 또는 HDR 과정을 거치는데, 이 과정을 이용하여 Knock-Out 또는 Knock-In 이 가능합니다.

CRISPR/Cas9 guide RNA 디자인 방법 Resource

아래 자료는 타겟 영역을 자르는 guide RNA를 디자인하는 방법을 잘 설명해주고 있습니다.

How to design sgRNA sequences by TAKARA

디자인된 sgRNA가 실제로 잘 작동할지를 컴퓨터로 예측해주는 많은 툴들이 개발되었는데, 아래는 그러한 툴들이 잘 정리되어 있습니다. 일반적으로 가장 절단 효율이 좋고, 특이적으로 작동할 것으로 예측되는 2~3개의 sgRNA를 만들어서 실제 실험을 하고, 가장 좋은 것을 이용한다고 합니다.

Choosing the right tool for designing guide RNAs

Broad Institute: GPP Webportal

마지막으로 Addgene에 CRISPR 기술에 대해서 잘 정리된 글이 있어, 함께 첨부합니다.

CRISPR Guide by Addgene