[실험실 노트] Real Time-PCR의 원리와 qPCR primer를 이용한 CNV 확인

오늘은 RT-PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction)의 기본적인 원리와 실험적으로 이용하기 위한 resource들을 정리하는 포스팅을 남기고자 합니다.

 

I. Realtime-PCR과 PCR의 차이

Realtime PCR (RT-PCR)은 그 이름에서 알 수 있듯이, 실시간 (Real-Time)으로 증폭 산물 (PCR product)을 Monitoring 한다는 것이 PCR과 가장 큰 차이입니다. 일반적으로 RT-PCR은 정량 (Quantitation)이 가능하기 때문에 qPCR이라고도 합니다.

• RT-PCR은 일반적으로 RNA에서 cDNA를 만든 후에 PCR을 진행하는 Reverse-Transcription PCR을 지칭합니다. 그러나, 경우에 따라 Realtime PCR도 약자로 줄여서 RT-PCR이라고 부르기도 하기 때문에, Reverse-transcription과 Real-time을 구분하여 혼동하시지 말기를 바랍니다. 이 글에서의 RT-PCR은 Real-time PCR을 지칭하는 것으로 하도록 하겠습니다.

이 때 일반적으로 Monitoring을 형광을 이용하게 되는데, DNA에 비특이적으로 끼어들어가 형광을 나타내는 SYBR과 Quencher를 이용하여, PCR 합성이 진행되면 형광을 나타내도록 하는 Taqman probe 등이 많이 사용됩니다.

[Taqman probe의 작동 원리]

최종 산물을 이용하는 PCR과 다르게 RT-PCR은 최초의 DNA 량을 역으로 정량 (또는 반정량)할 수 있다는 장점이 있습니다. 이를 위해서는 아래의 RT-PCR amplification curve를 잘 이해하는 것이 중요합니다. 일반적으로 PCR은 1 cycle이 돌 때마다 효율이 100% 라고 가정하면, 2배씩 증폭됩니다. 그러나, 실제로는 PCR에 dNTP들이 점점 소모되기 때문에 반응이 진행되면서 효율은 점점 떨어지게 되고, 아래와 같은 형태의 curve를 이루게 됩니다. 이때, 처음 증폭 산물을 검출할 수 있는 Threshold를 넘는 지점의 Cycle 수를 Ct 값이라고 이야기하고, Ct 값은 처음 DNA양과 역비례하게 됩니다. (즉, 처음 DNA 양이 많으면 증폭을 적게 시켜도 검출이 되고, 처음 DNA 양이 적으면 많이 증폭 시켜야 검출 한계를 넘게됩니다.)

II. qPCR primer design 및 활용 (Delta-delta Ct method)

qPCR은 PCR을 해서 증폭 산물을 얻는 것이 아니라, 해당 위치만 효율적으로 증폭시켜 추적하는 것이 목적이기 때문에 길이는 너무 길지 않는 것이 좋습니다. 따라서 target의 위치는 80~150 bp 정도로 되도록 하고, Melting curve analysis를 통해서 하나의 산물만 증폭되는 것을 확인합니다. 타겟 산물의 Tm은 65~95도 정도 되도록, GC나 AT rich region을 피합니다. 아래 2개의 사이트에서는 해당 유전자의 시퀀스를 넣으면 자동으로 primer를 디자인하여 주기 때문에 유용하게 사용 가능합니다. 더불어 하나의 미세한 팁은, Origene에서는 유전자별로 미리 디자인된 qPCR용 primer를 판매하면서 해당 시퀀스를 공개하고 있습니다. 따라서, 해당 시퀀스를 따와서 합성 주문하는 것도 한가지 팁이 됩니다. (다만, 가끔 잘못 올라온 경우도 있어서 합성 주문 전에 미리 잘 확인해볼 필요가 있습니다.) 최종 주문 전에 이전에 소개했던 툴 등을 이용하여, Hairpin structure, in-silico PCR 등을 돌려보는 것이 도움이 됩니다. 사실 이런 모든 과정이 귀찮다면, 마지막의 PrimerBank에서 검색해서 제시된 primer를 이용하면 됩니다.

관련 포스팅 보기>

[실험실 노트] Sanger sequencing Primer design

[qPCR primer design을 위한 툴]

GenScript RT PCR primer design tool

Eurofin qPCR primer design tool

OriGene pre-designed primer 정보 얻기

PrimerBank Database 활용 – **

일반적으로 RT-PCR은 정량 (Quantitation)이 가능하기 때문에 qPCR이라고도 하며, 일반적으로는 유전자 발현 상대량 (mRNA expression)을 구하거나, Copy-Number Variation을 확인하는 데 사용 가능합니다. 이 때, 중요한 개념은 ∆∆Ct method 인데, 서로 다른 2개의 target이라 하더라도 증폭되는 비율의 차이는 서로 다른 샘플 간에도 일정하다는 원리를 이용하는 것입니다. 이를 수식으로 나타내면 아래와 같습니다.

∆Ct = Ct (Gene of interest) – Ct (Reference gene)

즉, 하나의 샘플 안에서 서로 다른 2개의 타겟을 디자인해서 증폭하면, 위치 간에 증폭 효율이 있기 때문에 Ct 값에 차이가 필연적으로 존재합니다. 그러나 이 차이는 Gene of interest와 Reference gene간의 상대량에 변화가 없다면, 서로 다른 샘플 간이라 하더라도 일정해야 합니다. 그러나, 둘 간의 상대량에 변화가 발생하면 ∆Ct 값도 변화하게 되고, 따라서 ∆Ct의 차이 (∆∆Ct)를 계산하면, 원하는 타겟 (Gene of interest)의 상대량을 구할 수 있게 됩니다.

마지막으로 이러한 원리 (Delta-delta Ct method)를 이용하여, Copy-Number Variation을 구할 수 있는 실험에 대해서 잘 설명하고 있는 유튜브 영상을 남깁니다.

 

[References]

Ma, Lijiang, and Wendy K. Chung. “Quantitative analysis of copy number variants based on real‐time LightCycler PCR.” Current protocols in human genetics 80.1 (2014): 7-21.

How To Perform The Delta-Delta Ct Method